1.病毒的简单介绍

病毒含有 RNA 或 DNA 基因组，周围有病毒编码的保护性蛋白质外壳。病毒体的主要功能是将其DNA或RNA基因组递送到宿主细胞中，以便宿主细胞能够表达（转录和翻译）基因组。病毒基因组通常与相关的碱性蛋白质一起包装在对称的蛋白质衣壳内。核酸相关蛋白，称为核蛋白，与基因组一起，形成核衣壳。

图1：SARS-CoV-2病毒结构

2.病毒纯化方法的优缺点

2.1超速离心法

病毒浓缩和纯化的常见方法是基于病毒沉淀与超速离心的组合，然后使用透析或超滤进行缓冲液交换。这种方法非常适合二十面体对称、坚固的病毒，但不适用于颗粒大小不同的多形性病毒，并且在超速离心过程中通常会失去完整性。

2.2层析法

层析是另一种用于病毒纯化的方法。它可以有效去除污染物，同时保持颗粒完整性，从而确保良好的病毒回收率。整体柱上的离子交换色谱可用于纯化多形性病毒。优点是纯化和浓缩步骤结合在一起，并且由于低剪切力而保持了颗粒完整性。缺点是它需要苛刻的洗脱条件，并且通常需要额外的缓冲液交换步骤。使用尺寸排阻树脂是一种替代方法，可以在天然缓冲液中纯化多形性病毒。当装入层析柱时，病毒仍可能分解。

图2：膜过滤器可用于从溶液中去除细胞或病毒

3.病毒的分离培养

Vero-E6和 MK-2 (ATCC) 细胞保存在补充有 10% 胎牛血清和 1× 青霉素的改良 Eagle 培养基中-链霉素，37℃，5% CO2存在下。从标准螺旋盖培养管（16 × 125 mm；Thermo Fisher Scientific）开始病毒培养，细胞生长至 80% 至 90% 汇合时，接种含有 33 μl 样本和 2× 青霉素的 500 μl 病毒溶液-链霉素溶液，37℃吸收1小时。随后，将5ml由MEM、2%胎牛血清和1×青霉素-链霉素溶液组成的病毒培养基加入管中，将细胞维持在37℃培养箱中，每天观察细胞病变效应。首次接种后每 2 天使用从培养物上清液中提取的 RNA 进行 RT-PCR 分析，以验证目的病毒的存在。

4.测序

使用病毒 RNA 提取试剂盒（Macherey-Nagel，NucleoSpin RNA Virus）从含有病毒的上清液中分离出病毒目的基因组。如前所述，使用 Superscript IV（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）和随机六聚体（Thermo Scientific）在 10 µL 反应中将病毒 RNA 转录为 cDNA。使用Primalscheme设计用于全病毒基因组测序的多重引物。引物旨在通过 PCR 扩增约 450 bp 重叠片段。将截短的 Illumina TruSeq 接头序列添加到引物的 5' 端。根据制造商的方案使用MagSi-NGSPREP Plus磁珠(Magtivio)纯化获得的PCR产物。使用 v3 600 循环试剂盒在 Illumina MiSeq 测序仪上对纯化的 PCR 产物进行配对末端测序。

5.病毒的纯化/浓缩

步骤3收集的病毒储液在 15 ℃ 下以 10,000×g预净化 20 分钟，并用于下述进一步纯化/浓缩方法。

5.1病毒制粒

为了沉淀，将 9.5 mL 预净化的含病毒上清液铺在 1.5 mL 20% (w/v) 蔗糖缓冲垫上，缓冲液中含有 20 mM HEPES 和 155 mM NaCl，pH 7.0 (HN)，并离心 2小时，100,000×g，4℃。弃去上清液，用 HN 冲洗可见沉淀以除去剩余的蔗糖，并在 4 ℃ 下重悬于 200 µL HN 中过夜。

5.2.使用尺寸排阻树脂纯化目的病毒

使用 10 体积的 HN 缓冲液将尺寸排阻色谱树脂 Capto Core 700洗涤六次。将 1.2 mL 等份的 Capto Core（床体积）添加到 12 mL 预澄清的上清液中，并在 4 ℃ 下旋转 20 分钟。通过在 800×g、4℃下离心 3 分钟来沉淀树脂，并收集含有病毒的上清液。使用新鲜等份的 Capto Core 树脂重复该过程。使用具有 100 kD MWCO 的 4 mL Amicon Ultra 超滤装置将纯化的病毒浓缩至最终体积 150 µL。

图3：病毒分离纯化主要流程

6.质谱

肽样品用 C18 Macrospin 柱（Nest Group）脱盐后，使用 Evosep One 液相色谱系统通过 CaptiveSpray 纳米电喷雾离子源与混合捕获离子淌度四极杆 TOF 质谱仪 (Bruker timsTOF Pro) 联用，对脱盐样品进行分析。

7.低温电子显微镜和断层扫描

对于冷冻电镜，使用 Leica EM GP 柱塞，在 22 °C、85% 湿度和 3 s 印迹时间下，将病毒样品玻璃化在带有多孔碳膜（R1.2/1.3，网目 300）的辉光放电 Quantifoil 电子显微镜网格上印迹。

病毒的分离纯化本质是蛋白的分离纯化。w66最给力的老牌生物可以提供优质的天然蛋白纯化服务，多种蛋白纯化系统（亲和色谱、离子交换、分子筛、疏水色谱、HPLC等）可供选择，先进的AKTA纯化系统和多种规格的预装纯化柱能够纯化各种不同来源的重组蛋白或天然蛋白，纯化周期只需2-3周，即可交付您高纯度的蛋白及相关实验数据。