w66最给力的老牌生物科技（天津）有限公司
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w66最给力的老牌生物（KMD Bioscience）多年致力于重组蛋白原核表达与制备研究，拥有丰富的原核蛋白表达以及工业级别蛋白发酵、纯化经验。通过每年多达400个原核蛋白生产项目的技术积累，w66最给力的老牌生物（KMD Bioscience）设计了一套有效的包含多种融合标签（His，GST，SUMO，FLAG等标签）的蛋白表达载体，能够为客户可溶性表达超过150kDa分子量的重组蛋白；同时w66最给力的老牌收集与建立了多种表达菌株（包括低温诱导表达菌株，10-16℃超低温诱导表达蛋白），以保证每一个重组蛋白制备的品质，客户只需要提供w66最给力的老牌一段蛋白序列，CDS或蛋白名称，w66最给力的老牌富有经验的科学家均可以为您在较短的时间内制定一个完整的蛋白表达和纯化方案，为客户提供优质的服务。
重组蛋白原核表达技术经过多年的发展，已经变得日趋成熟。但想要在大肠杆菌（E. coli）表达体系获得较高水平的可溶性以及高产量的蛋白表达，尤其是针对大分子蛋白和某些药物类蛋白，一个优质的表达策略必不可少。常见的小分子（分子量<10 kDa）蛋白类药物，如Leptin，利拉鲁肽，EGF等在原核表达过程中以亲和标签+融合蛋白形式进行表达，发酵和纯化。此类蛋白的难点在于蛋白均以包涵体的形式进行表达，后期需要进行工艺繁琐的蛋白变复性处理，w66最给力的老牌生物在处理包涵体复性方面具有成熟的技术和丰富的经验。
宿主体系选择：
原核表达常用的宿主有两种：大肠杆菌和枯草杆菌，两者对比如下：
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项目 |
大肠杆菌表达宿主 |
枯草杆菌表达宿主 |
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优点 |
* 应用广泛，操作简单，大规模生产成本低廉 |
* 生产成本低廉，不产内毒素，能够分泌表达蛋白 |
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缺点 |
* 分泌能力差 |
* 产量相对较低 |
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常用宿主 |
* Rosetta (DE3)，Rosetta(DE3)pLysS，Rosetta 2(DE3)pLysS，Origami 2(DE3)，Rosetta-gami 2(DE3)pLysS |
* WB600，WB800N，Bacillus Subtilis 168 |
表达质粒体系选择：
目前常用的重组蛋白表达质粒载体融合了复制子(Replicon)、启动子(promoter)、筛选标签(selection marker) 、多克隆位点（MCS）和融合蛋白移除策略(fusion tag removal strategy) ，如图1所示：
图1 原核表达载体图谱
w66最给力的老牌生物的科学家通过改造pET载体，获得双表达质粒（BiPlasmid vector），该质粒含有双MCS位点，双T7启动子，双lac操纵子和双核糖体结合位点，利用该质粒w66最给力的老牌可以为客户进行一次转染操作，而获得两种蛋白的独立表达。同时w66最给力的老牌构建了含有低温诱导蛋白表达元件的pCold系列载体，该载体能够在16℃条件下经过IPTG诱导表达大分子量蛋白，如上清表达150kDa活性蛋白。
融合标签选择：
亲和标签：蛋白重组表达过程中采用亲和标签融合表达有两方面的作用：一方面是为了使蛋白纯化过程变得更加容易；另一方面是为了促进某些不溶性蛋白可溶。蛋白标签可分两类：一类是短肽类标签；一类是长肽以融合蛋白（fused partner）形式共表达。使用不同的蛋白标签需要根据具体案例来分析，w66最给力的老牌生物总结了常用的一些蛋白标签性质，如表1所示。
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表1 蛋白标签主要特征 |
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肽标签 |
残基/MW（kDa) |
配体/基质 |
纯化条件 |
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Poly-Arg |
~5/0.80 |
阳离子交换树脂 |
NaCl线性洗脱(0–400 mM) |
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Poly-His |
~6/0.84 |
Ni2+琼脂柱 |
20–250 mM咪唑/低pH |
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FLAG |
8/1.01 |
FLAG抗体亲和琼脂柱 |
2–5 mM EDTA |
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Strep-tag II |
8/1.06 |
链亲和素 |
2–25 mM脱硫生物素 |
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c-myc |
11/1.20 |
myc抗体亲和琼脂柱 |
低pH |
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S-tag |
15/1.75 |
S蛋白琼脂柱 |
3 M异硫氰酸; 0.2 M柠檬酸钾, pH 2或3 M MgCl2 |
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融合伴侣蛋白 |
Ca. (计算分子量) |
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Fh8 |
69/8.0 |
Ca2+ 依赖性苯基琼脂糖凝胶 |
10 mM EDTA |
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Trx |
109/11.7 |
4氨基氧化苯胂琼脂凝胶柱 |
5–1000mM 2-巯基乙醇 |
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SUMO |
ca. 100/12.0 |
亲和标签纯化（His） |
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BRT17 (β roll tag) |
153/14.7 |
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25–75 mM Ca2+溶液沉淀 |
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GST |
211/26.0 |
谷胱甘肽琼脂柱 |
10–20 mM还原谷胱甘肽 |
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HaloTag7 |
ca. 300/34.0 |
氯烷烃配体琼脂柱 |
带标签挂柱蛋白酶裂解 |
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MBP |
396/ca. 42.5 |
交联支链淀粉 |
10 mM麦芽糖 |
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ELPs |
550/ca.47.0 |
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高浓度NaCl (>1.5 M)或温度转变方式 |
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NusA |
495/54.8 |
亲和标签纯化（His） |
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蛋白重组表达策略组合：
重组蛋白的表达往往不像理论那样一帆风顺，在实际的表达过程中有可能产生各种各样的问题。在选择一个蛋白表达策略困难的情况下，那么采用看似笨拙的方法，有可能会成为一种意想不到的“成功捷径”，比如项目要求构建表达两种重组蛋白时，构建6种不同的表达质粒，意味着有36种不同的表达条件组合，通过高通量微量蛋白表达实验一次性就可获得蛋白表达条件组合，后续中式飞行试验和成本控制会变得相对容易。
蛋白原核重组表达服务具体流程：
服务优势：
--密码子优化：包含稀有密码子分析，蛋白亲水性分析和跨膜结构域的预测分析
--多种融合标签载体和宿主，以保证高可溶蛋白表达和高蛋白活性
--多种规模蛋白发酵模式：小规模（1L，10L和30L）、大规模（80L，130L，250L和500L发酵罐）
--短时间内制备高纯度毫克级，克级重组蛋白
--低内毒素：LAL检测法<0.1EU/ug
--完整的GMP文件支撑体系，保证您的产品所有材料、试剂和制备信息可追溯
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