w66最给力的老牌生物科技（天津）有限公司
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w66最给力的老牌生物（KMD Bioscience）多年来致力于细胞生物学技术研究，在稳定细胞株构建方面积累了丰富的经验，w66最给力的老牌生物的科学家拥有多年实验成功案例，熟悉实验环节中的每一步操作，尤其对关键步骤具有独到的经验，能够凭借精湛技术快速完成实验内容，为客户节省宝贵的时间和经费。目前我司已成功为众多科研客户构建获得大量目的细胞株。w66最给力的老牌构建的细胞系可直接应用于下游的生物学研究，w66最给力的老牌生物建立了完善的细胞实验服务平台，提供一体化的工业生产式技术服务，与国内知名研发单位合作推出完备的CRISPR/Cas9载体系统，包括单敲除、双敲除、缺口酶、慢病毒敲除载体和敲除载体库等体系，并且每一个载体系统都有不同的标签（EGFP/RFP/Puro/Neo）可供选择，能够为客户提供快速、准确的基因敲除项目服务。w66最给力的老牌生物依托先进的技术和经验丰富的科研团队，可为客户提供系统的CRISPR/Cas9敲除细胞系构建服务。
CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是新出现的一种由sgRNA指导Cas核酸内切酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。CRISPR/Cas9系统广泛存在于原核生物基因中，是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的一种适应性免疫防御机制。在这些生物体中，来自噬菌体的外源遗传物质获得和整合入CRISPR位点。这些序列特异的片段被转录成短CRISPR的RNA（CRISPR-derivedRNA），crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，然后tracrRNA/crRNA复合体指导Cas9蛋白切断双链DNA。随着CRISPR/Cas9技术的不断发展，该技术已广泛应用在各物种中，CRISPR/Cas9系统的基因编辑准确，操作便捷，可进行多重靶向修饰，是目前普遍使用的基因编辑技术。
CRISPR/Cas9系统技术：
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CRISPR/Cas9技术 |
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实验原理 |
* 该技术的工作原理是：噬菌体等外源DNA入侵时，Cas蛋白复合物通常识别 3' 端含NGG的前间隔序列邻近基序 (PAM) 区域。然后，侵入的噬菌体或质粒释放的短DNA片段，插入宿主 CRISPR 位点中。在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA（crRNA）通过碱基配对与转录激活crRNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）退火形成能够特异识别基因组序列的复合体，然后通过PAM（5’-NGG-3’）序列结合并侵入DNA，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strand breaks，DSBs）。 这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA（single-guided RNA）进行简化。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但由于结构得到了简化，更方便研究者使用。通过电刺激转染的方法直接将Cas9蛋白和sgRNA复合物转染到细胞中，便能够对目的基因进行操作。 |
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优点 |
* 具有编辑效率高、构建简单、操作方便等优点
* 使用更加严苛的筛选标准，可以更有效地去除假阳性
* 能够成本低廉地实现有效灵活的基因敲除
* 具有广谱性，无基因、细胞及物种限制
* 可实现多个靶位点同时进行基因打靶
* 功能丰富，可实现敲除、插入、抑制、激活等多种目的基因 |
图1：CRISPR/Cas9介导的基因组编辑原理图
项目流程：
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微生物 |
乳酸菌、沙门氏菌、大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、不动杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，等 |
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植物 |
服务优势：
--效率高、系统稳、脱靶低、性价比高，服务透明化
--可对同一细胞进行多个基因敲除实验
--可提供各种哺乳动物细胞的稳转细胞系构建服务
--可提供基因敲除、过表达、沉默、定点整合等各种类型基因编辑服务
--提供多种不同荧光和抗性标记的表达载体，更易筛选到基因敲除成功的细胞
--严格的质控体系，丰富的成功经验
--优化转染载体系统以确保细胞可以稳定高效地表达
--采用高标准的qPCR验证基因的表达情况
--具备完善的细胞、蛋白等服务平台，能够提供从sgRNA设计到蛋白检测等一站式技术服务
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