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1、为什么实验结果显示细胞提取液中没有我的目的蛋白？

答：

（1）这种细胞可能不表达目的蛋白质，可以选择换一种细胞试试；

（2）若是细胞没有问题，则要考虑蛋白质是不是被蛋白酶降解掉了或样品保存不当，如存放时间过久；可以加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性或重新提取蛋白进行实验；

（3）抗体与目的蛋白的不符合，抗体不能识别目标蛋白，可以查查文献，看目的基因对应哪个种抗体；

2、我的目的条带很弱，如何改进可以使条带加强呢？

答：

（1）可能使目的蛋白少，可以选择加大蛋白提取液的上样量或将一抗稀释比例降低；

（2）还可以在最后结果观察时延长曝光时间；

（3）转膜不完全或转膜过度，可以用丽春红作为转膜的指示剂，对膜上的蛋白染色，而膜的其他部分不会被染色，这样就能大概确定条带是否转至膜上；并且要根据蛋白的分子量适当的调整转膜的时间和电转强度。

3、为什么检测出的蛋白分子量比资料上的大呢？

答：可能是目的蛋白形成了二聚体或蛋白本身有修饰如糖基化、磷酸化基团等，这些都会导致目的蛋白的分子量变大，可以在煮沸变性时，延长时间，有助于打开二聚体。

4、在WB结果中背景不干净，这是为什么呢？

答：

（1）封闭液封闭膜的时间不够，首先要选择合适的封闭液，其次延长封闭时间；

（2）一抗浓度太高了，需要对抗体进行稀释；

（3）一抗孵育的温度偏高，建议在进行一抗孵育时，采用4℃过夜孵育的方法；

（4）选择的膜容易产生高背景，一般NC膜的背景会比PVDF膜低，但是NC膜吸附力也就差了一点。

（5）膜没有完全均匀湿透，并且在实验过程中用手套反复接触过膜，因此实验过程中一定要注意保持膜的湿润，取膜时用镊子夹取；

（6）检测时的曝光时间过长，可减少曝光时间。