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斑点杂交（dot blot）是一种检测、分析和鉴定 DNA、RNA 和蛋白质的技术，在斑点印迹中，要检测到的生物分子不是首先通过电泳分离出来的，而是将含有被检测分子的混合物直接点在膜上，烘烤固定。然后用核苷酸探针或抗体杂交后检测。通过显影斑点的有无及颜色的深浅来判断是否有杂交及其杂交强度。作为目前高等真核生物和植物中最丰富的一种 RNA 转录后修饰，m6A 修饰能够调控 RNA 的剪接与转运、稳定性、出核和翻译成蛋白质的效率。因此在研究 RNA 的 m6A 修饰时经常用到斑点杂交来对细胞内总 RNA 的 m6A 修饰水平进行定性或半定量分析。

原理

m6A 斑点杂交是指将待测的 RNA 变性后点加在硝酸纤维素膜或 NC 膜上，紫外交联固定后用 m6A 抗体进行杂交，洗膜，放射自显影，以斑点有无或颜色的深浅代表 m6A 修饰水平的高低。

用途

检测细胞内总 RNA 的 m6A 修饰水平变化。

材料与仪器

m6A 抗体（能做斑点杂交的抗体）、20 × SSC 缓冲液、混合床树脂 PCR 仪、硝酸纤维素膜、中波 302 nm 波长的紫外灯、PBST、二抗 IgG、亚甲基蓝粉末、醋酸钠（M=136）、ECL 显影液和化学发光成像仪。

试剂配制：

（1）PBST 缓冲液配制：商业化的 PBS 粉末加 2 L 蒸馏水溶解，随后加入 1 mL 的 Tween-20，混匀即可使用，室温保存。

（2）37% 去离子甲醛配制：0.3 g 混合床树脂加入 3 mL 国药甲醛，来回混合，使树脂部分由蓝色变成金黄色，短暂离心后小心吸取上清分装，室温保存。

（3）亚甲基蓝溶液配制：称取 20 mg 亚甲基蓝粉末溶解于 10 mL 0.3 mol/L 的醋酸钠溶液中，充分溶解后形成深蓝色溶液，室温保存。

（4）0.3 mol/L 醋酸钠溶液配制：称取 20.4 g 醋酸钠溶解于 500 mL 去离子水中，加入盐酸，调节 pH=5.2 左右。

步骤

1、用 Trizol 试剂从细胞中分离出总 RNA，尽量将不同处理组的 RNA 浓度调整一致。

2、配置变性液（RNA 变性液由 20 × SSC 缓冲液：37% 去离子甲醛=3:2 配成）；将变性液与 RNA=1:1 混匀，PCR 仪中 95 ℃ 反应 5 min，使核酸变性。

3、将不同浓度的标准品稀释液、样品、阴性对照、阳性对照，各取2ul点在硝酸纤维膜上，随后在 302 nm 紫外灯下照射交联 6 min。

4、交联后，用 PBST 缓冲液洗涤膜 5 min；然后用 5% 的脱脂奶粉室温封闭 2 h，用 PBST 缓冲液洗涤膜 5 min，再用 m6A 抗体在 4 ℃ 下孵育过夜。

5、随后在 PBST 缓冲液中洗涤 4 次，每次 5 min，用对应的二抗 IgG 在室温下孵育 2 h，再用 PBST 缓冲液洗涤 4 次，每次 5 min。

6、利用 ECL 显色液进行 ECL 显影。

7、亚甲基蓝定量核酸：取一张同样处理的膜，滴加等同体积的样品，经过紫外交联之后，进行亚甲基蓝染色，将膜放置于溶液中染色 10 min，PBST 洗涤 10 min，期间更换多次 PBST 后，拍照。

注意事项

1、亚甲基蓝很难清洗，实验操作中要记得戴口罩和穿白大褂。在进行亚甲基蓝染色时，注意尽量不要吸取底部沉淀。

2、核酸变性液要现配现用。

3、变性后的 RNA 可放在 4 ℃ 冰箱，一个星期内做完实验即可。

4、在硝酸纤维素膜上点样时，要用水性笔在膜上做好标记，以免记错顺序。

5、点样时，速度要快，要用无 RNA 酶的枪头进行点样，每个样品需要更换枪头。

6、点样时，样品体积最好不要超过 1 μL，以免造成扩散，不能很好的形成斑点。

7、化学发光成像仪的选择也有略微的区别，最好选择可以自己调整曝光时间的化学发光成像仪。

常见问题

1、显影的时候容易过曝？

答：降低上样量，在做正式试验前最好先自己找一下最好的浓度范围。一般可以从 500 ng~100 ng 的一个范围都可以。

2、亚甲基蓝染色后，斑点不明显？

答：一般来说，亚甲基蓝染色 10 min 即可。但是也需要根据自己具体的上样量调整染色时间。可以在染色过程中用镊子（镊子最好是平头的，不易损伤硝酸纤维素膜）夹出来观察，当看到清晰可见的蓝色圆点就可以停止染色。同样脱色的时间也需要自己时刻观察，一般当观察到背景色和斑点的颜色可以明显区分的时候即可。