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瞬时表达系统

稳定表达系统

诱导表达系统

宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时间较短。相对于稳定表达系统，瞬时表达系统无需将外源基因整合到基因组上，避免了外源基因整合过程中位置效应的影响。

载体导入宿主细胞后，目的基因整合到细胞基因组上，不会随着细胞传代而消失，能够长期稳定的生产目的蛋白。

目的基因的转录受外源小分子的诱导，可在特定的时间或特定的组织、细胞类型内表达，经诱导后目的基因的表达可大大提高。目前，基于四环素或多西环素的调节系统以及雌激素受体他莫昔芬系统应用较为广泛。

优点：表达周期短，表达量高等。

缺点：技术条件要求高，如质粒的纯度、转染的效率等。

优点：目的蛋白表达持久、稳定。

缺点：由于需要抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。

参与诱导调控的因子与细胞内源性的因子间无相互作用，因此一方面目的基因的表达本身不受细胞内环境改变的影响，另一方面诱导药物对内源基因的表达无作用，因而具有很好的严谨性和特异性。

表达方式

细胞

瞬时表达

HEK293细胞，源于293细胞系，采用无血清悬浮培养；CHO-S细胞，源于中国仓鼠卵巢细胞的克隆分离株，被驯化为无血清悬浮培养。

稳定表达

CHO-S、CHO-K1由CHO衍生而来，该细胞株培养条件简单、贴壁强度适中，比较容易转染。

控制元件

分类

原核序列

包括原核复制子；抗生素抗性基因；多克隆位点

启动子

病毒来源：SV40（绿猴空泡病毒）；CMV（巨细胞病毒）；RSV（肉瘤病毒）；ADV（腺病毒）；LTR（逆转录病毒长末段重复序列）；细胞来源：HSP（热休克蛋白）

增强子

增强子通常占100-200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，其基本核心组件常为8-12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。

常用增强子：SV40 enhancer；CMV enhancer；RSV enhancer；LTR enhancer

终止信号和poly A信号

功能是使转录后的mRNA能有效进行切割和加上polyA尾巴也就是多聚腺苷化，poly A增加mRNA的的稳定性，多聚腺苷化所需的两种序列：（1）位于polyA下游GU丰富区或U丰富区；（2）位于poly A上游11-30bp处的5’ –AAUAAA

选择标记基因

胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）、新霉素抗性基因（neo）和氯霉素乙酰转移酶基因（cat）

腺病毒载体

腺相关病毒载体

逆转录病毒载体

慢病毒载体

Ad病毒颗粒的直径为70-90nm，呈20面体立体对称型，核心外层的壳体由252个壳粒亚单位组成。不同亚型Ad病毒的DNA的G+C%含量不同，与其致瘤性能强弱有关

线状单链DNA病毒，缺陷型非病原性人类细小病毒，与人类疾病无关

是一类RNA动物病毒;基因组含有2条相同的正链RNA分子，病毒颗粒内部含有tRNA引物分子、反转录酶、RNaseH和整合酶等组分；病毒可分为两类:泡沫病毒类群:（如人泡沫病毒(HFV)）和慢病毒类群:（HIV Ⅰ和Ⅱ型致癌病毒类群）

RNA病毒；现有常用的慢病毒载体主要由猫免疫缺陷病毒（FIV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）慢病毒改造而来．目前慢病毒载体系统一般为四质粒表达系统，分别为两个包装质粒、包膜质粒和慢病毒表达质粒。

优点:安全性高，滴度高，容量大(36kb)，可感染非分化细胞，可直接体内应用，原位感染组织；是目前基因治疗的最常用载体。

缺点:免疫原性高，表达时间短；无组织特异性；真核细胞内筛选复杂，费时。

优点：感染细胞范围广，可感染分裂期与分裂后期细胞；野生型病毒可定点整合；90%以附加形式存在，10%整合；免疫原性弱，可反复感染。

缺点：外源基因插入容量小，<=4.7kb；缺少高效的包装细胞，制备过程复杂；随机整合，制备滴度低，存在一定的免疫反应。

优点：宿主范围广泛，具有强启动子，感染效率高，被感染或转化的细胞可以持续传代。

缺点：不能整合非分裂细胞，只能包装10Kb以下的外源基因，载体与内源性逆转录病毒序列发生重组产生有复制能力的逆转录病毒，以及病毒随机整合而产生致癌的可能性。

优点:不仅对分裂期细胞有感染能力，对非分裂期细胞也有感染能力；宿主范围广；较大容量(7~8kb)；以转染方式主动感染宿主细胞，整合入基因组中以长期稳定存在。

缺点：仅整合到处于增殖状态的细胞;随机整合插入有诱变危险；组织或细胞选择性不高。