1.什么是噬菌体展示

噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面并保持特定的空间构象，利用特异性亲和作用以筛选特异性蛋白或多肽的一项新技术。

图1：噬菌体展示技术

2.噬菌体文库筛选应用

噬菌体展示文库技术是一种新兴的生物技术，利用噬菌体展示技术获得的外源蛋白保持独立的空间结构和生物活性，目前在新型疫苗的研制，酶抑制剂的筛选，医学诊断和治疗，多肽药物的开发，抗原表位分析，，蛋白相互作用的研究等领域得到了广泛的应用，并显示了良好的应用前景。

3. 噬菌体展示系统的分类

噬菌体展示中较常用的噬菌体是大肠杆菌丝状噬菌体M13、T4 、T7噬菌体。

3.1 大肠杆菌丝状噬菌体（f1、fd、M13）

丝状噬菌体是一种噬菌体，由其丝状或杆状形状定义。丝状噬菌体通常包含单链 DNA 基因组并感染革兰氏阴性细菌。在噬菌体展示中Ff、M13、fd 和 f1 家族是重要的噬菌体，其中 M13 噬菌体较常用。

M13噬菌体呈圆柱形，长880nm，直径6nm。它封装了一个单链基因组，该基因组编码五种不同的衣壳蛋白，其中包括两组，主要外壳蛋白 (pVIII) 和次要外壳蛋白 (pVII、pIX、pVI 和 pIII)。

大肠杆菌丝状噬菌体通常用于噬菌体展示。大多数抗体和多肽都展示在噬菌体蛋白pIII 和pVIII 上，从而构建了pIII和pVIII展示系统。此外，杂交噬菌体系统能够将具有所有五种 M13 外壳蛋白的大蛋白展示为与 pIII、pVIII、pVII 和 pIX 的 N 端融合，以及与 pVI、pIII 和 pVIII 的 C 端融合。

图2：M13噬菌体

pIII是决定病毒颗粒感染性的蛋白质。它由 406 个氨基酸残基组成，以 3 到 5 个拷贝出现在噬菌体尖端。使用 pIII 而不是 pVIII 的一个优点是，当使用结合辅助噬菌体的噬菌粒时，pIII 允许单价展示。此外，pIII 允许插入更大的蛋白质序列（>100 个氨基酸），并且比 pVIII 更耐受。

pVIII是 Ff 噬菌体的主要外壳蛋白，由基因 8 表达，存在 2700 个拷贝。因此，当噬菌体展示的抗体与抗原结合时，它被用来增强检测信号。肽通常融合到 Pviii 的 N 末端，通常有 6-8 个氨基酸长。这使得使用这种蛋白质不利于发现高亲和力结合伙伴。此外，对pVIII进行修饰以提高在pVIII上的展示效率，目前已经取得了很大进展。

pVI已广泛用于 cDNA 文库的展示，由于其高通量能力，它是 yeast-2-hybrid 方法的一种有吸引力的替代方法，可用于发现相互作用的蛋白质和肽。pVI 优先于 pVIII 和 pIII 用于 cDNA 文库的表达，因为可以在 pVI 的 C 末端添加感兴趣的蛋白质，而不会显着影响 pVI 在噬菌体组装中的作用。

pVII和pIX位于与 pIII 相对的噬菌体尖端，可以补充当前的噬菌体展示系统，并用作展示和选择的替代支架，以进一步改进噬菌体展示作为最终的组合工程平台。

3.2  T4噬菌体

T4噬菌体（Enterobacteria phage T4）是一种感染大肠杆菌的噬菌体。它是 T-even 噬菌体的成员，该组包括肠杆菌 T2 和 T6。T4 噬菌体是一种相对较大的噬菌体，宽约 90 nm，长约 200 nm。它的双链 DNA 基因组长约 169 kbps，编码 289 种蛋白质。T4 噬菌体由三种必需蛋白质组成：gp23，形成六角衣壳格；gp24，在十二个顶点中的十一个形成五聚体；和 gp20，它形成独特的十二聚体入口顶点，DNA 在包装过程中通过它进入，在感染过程中通过它离开。

图3：T4噬菌体

除了必需的衣壳蛋白 gp23、gp24 和 gp20，T4 衣壳还装饰有两种非必需的外衣壳蛋白：HOC（高抗原性外衣壳蛋白）和 SOC（小外衣壳蛋白）。HOC和SOC都是可有可无的，在衣壳组装完成后与衣壳结合。

HOC 和 SOC 是可有可无的 T4 衣壳蛋白，可用于多肽和蛋白质多拷贝的噬菌体展示。噬菌体 T4 HOC、SOC 双分展示系统对于在噬菌体衣壳表面上以高拷贝数表达 cDNA 和展示肽或蛋白质具有吸引力。它可以应用于 cDNA 表达，以高拷贝数展示较大的蛋白质，并在出现 810 个拷贝的 SOC 蛋白的 C 端或出现在 155 个拷贝的 HOC 蛋白的 N 端插入终止密码子。因此, 噬菌体 T4 双位点展示成为一种强大的方法，可增强动物的免疫反应，用于研究和开发免疫产品。

3.3  T7噬菌体

T7 噬菌体是 Podoviridae 家族的二十面体病毒，具有线性双链 (ds) DNA 基因组。与 T4 相似，噬菌体 T7 具有头尾结构。T7 保存其 dsDNA 基因组的二十面体头部由 415 个拷贝的衣壳 gp10 组成，在表面排列为 60 个六聚体，在顶点排列为 11 个五聚体。主要外壳蛋白 gp10、gp10A 和 gp10B 存在两种同种型，比例为 9:1，由氨基酸 341 处的自然翻译移码引起。

图4：T7噬菌体

次要蛋白 gp10B 由基因末端的移码引起，使衣壳蛋白 52 个残基更长。融合蛋白显示在 52 个额外残基的蛋白 gp10B C 端。这样就可以避免与空间位阻有关的问题。T7 噬菌体颗粒在各种极端条件下表现出高稳定性，包括高温和低 pH 值，这有助于有效的高通量亲和淘洗。T7 噬菌体展示系统的最终应用有助于揭示分子相互作用的机制，特别是在抗原发现、疫苗开发、蛋白质相互作用以及癌症诊断和治疗领域。

4.w66最给力的老牌生物为客户提供的全流程介绍

w66最给力的老牌生物为客户提供噬菌体文库构建服务，流程包括：总RNA提取，反转录获取cDNA，PCR扩增，载体与 PCR 产物酶切连接，细菌文库构建，噬菌体文库构建，噬菌体文库效价检测。

图5：噬菌体展示抗体库构建流程

4.1总RNA提取

将外周血淋巴细胞从冰箱取出后分装，通过化学试剂沉淀溶解，用核酸浓度测量仪测浓度。

4.2反转录获取cDNA

按照商业化试剂盒操作说明书上一步得到的RNA反转录获得cDNA。

4.3 PCR扩增

以 cDNA 为模板进行两轮PCR反应。

4.4载体与PCR产物酶切连接

将PCR产物酶联接到噬菌体质粒pADL-10b中，构建噬菌体质粒库。

4.5细菌文库构建

将连接产物进行电击转化后构建含有目的抗体片段的大肠杆菌文库。

4.6噬菌体文库构建

上一步的噬菌体菌文库进行扩增，制备得到噬菌体文库。

4.7噬菌体文库效价检测

噬菌体文库通过稀释培养，即可计算效价。