利用pFastBac1进行目的蛋白的表达的时候，根据方式的需要以及融合表达目的蛋白以提高其表达量的需要，可以在质粒构建时添加His标签或GST标签。为了防止额外添加的His和GST等蛋白标签影响目的蛋白的生物学功能和结构研究，可在融合蛋白和标签之间添加蛋白酶酶切位点，如TEV或PreScission的酶切位点。如果蛋白主要以可溶形式表达，离心收集昆虫细胞，超声裂解细胞，但由于昆虫细胞内蛋白酶种类比较多，需要添加各种。离心收集超声后上清，使用镍柱或GST柱等纯化目的蛋白。同时可以利用离子交换、分子筛层析等进一步纯化目的蛋白。纯化获得的蛋白，可以添加适量甘油后保存，或者如果有需要也可以适当浓缩后保存等。

蛋白表达纯化详细步骤：

一、杆状病毒制备与鉴定

培养昆虫细胞至密度达到5×10⁶~1×10⁷活细胞/ml，活性≥90%。用培养基将细胞稀释成2.5×10⁶活细胞/ml 稀释液，27℃、127 r/min 恢复25 min。用Opti⁃MEMTMI 无血清培养基稀释 ExpiFectamineTMSf 转染试剂，并加入 Bacmid DNA（pc1⁃mfp5以及gus），室温孵育5 min，随后滴加到100 ml细胞稀释液中。27℃、127 r/min孵育72~96 h至细胞存活率降至 60%~80%，300×g 离心 5 min，保留上清即P0代病毒。

使用 ExpiSfTMCD 培养基制备连续 10 倍的病毒稀释液（10^-2、10^-3、10^-4、10^-5），并在培养基中将细胞稀释至1.25×10⁶活细胞/ml。将1 ml 病毒稀释液添加到24深孔板中（每个稀释液1孔），随后将1 ml ExpiSfTMCD培养基添加到无病毒的阴性对照中。将800 μl细胞悬液添加到8个病毒稀释液以及阴性对照孔中，并在27℃、227 r/min 摇床中避光孵育14~16 h。将24深孔板中细胞分别取出，300×g离心5 min，弃上清。细胞沉淀重悬于100 μl 稀释的gp64APC抗体中，涡旋 3~5 s，室温孵育 30 min，PBS洗涤后重悬于1 ml胎牛血清稀释液中，通过流式细胞仪进行鉴定。

二、与鉴定

培养细胞至细胞密度达到 5×10⁶~1×10⁷活细胞/ml，活性≥90%，用培养基稀释至最终密度为5×10⁶活细胞/ml，立即加入ExpiSfTM转染增强剂，在127 r/min，27℃摇床上孵育18~24 h。当细胞密度恢复至5×10⁶~7×10⁶活细胞/ml，活性≥80%时分别使用病毒感染复数（multiplicity of infection，MOI，平均每个细胞的病毒感染数）30、60 以及 120的杆状病毒感染细胞，27℃、127 r/min培养直至细胞活性降至30%以下，300×g离心5min取上清。取200 μl细胞上清液以及细胞裂解液分别加入50 μl 5×SDS缓冲液，沸水煮6 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，在90 V、90 min的状态下电转至醋酸纤维膜上。5% 脱脂奶粉封闭1 h，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳验证目的蛋白的表达情况，纯化之后还可以通过SDS-PAGE验证，结合灰度分析验证蛋白的纯度

w66最给力的老牌生物拥有完善的，昆虫细胞蛋白表达系统适合于膜蛋白的重组表达，4次及以下跨膜蛋白几乎可以有效地在昆虫细胞中进行表达和纯化。膜蛋白的纯化是一件比较耗时耗力的事情，w66最给力的老牌生物科技可以提供高纯度的全长膜蛋白定制产品。w66最给力的老牌可以为客户提供整套的蛋白表达方案，w66最给力的老牌免费对客户提供的基因进行序列分析检测；同时根据Sf9，Sf21，Hi-5及S2昆虫细胞的密码子偏爱性，免费为您进行密码子优化，从而有效提高重组蛋白表达量，为您提供一站式服务。