一．蛋白质纯化技术

主要内容是指利用要分离的多种蛋白质组分之间蛋白的性质差异，首先依据蛋白的质量相似性可以进一步去除其他非蛋白型物质，再分别根据蛋白质之间的差异性可以将目的蛋白分离提取出来。

二．蛋白纯化方法

1.标签纯化法

标签分离纯化相对应用于其他蛋白质纯化检测方法来说，技术比较成熟，操作比较容易，理想的蛋白质标签应该具有至少以下这么几个共同特点：（1）标签对分离目标蛋白酶的基本结构类型和生化活性基本上没有产生影响作用；（2）标签比较方便切除；（3）样品最好是能经过一步的纯化处理即可得到超纯品；（4）产品应用领域范围更广，可分别适用于多种生物目标蛋白检测和基因表达诊断系统。纯化标签需要根据实际情况选择，下表是部分常用标签：

纯化标签	纯化原理	洗脱方法
His-Tag	在中性和弱碱性条件下可以和固定化的金属离子相互作用(如Ni离子，Zn离子，Co离子等)	降低pH或咪唑
GST	GST(谷胱甘肽S-转移酶)能特异地与其底物谷胱甘肽结合	还原谷胱甘肽
FLAG	FLAG标签与抗FLAG抗体之间的特异性结合	低pH或EDTA
Strep II	生物素(biotin)和链霉亲和素(streptavidin)之间的相互作用	兼容多种缓冲条件：高盐，洗涤剂，金属离子，螯合剂，还原剂
Protein A	Protein A可以和IgG进行特异性结合	低pH
MBP	MBP可以与含有葡聚糖配基的填料特异性结合,达到快速、高效的捕获与纯化目的	麦芽糖
Halo	利用Halo-Tag酶基于化学共价的方式将融合蛋白质与特定化学物质之间实现共价结合

w66最给力的老牌针对蛋白纯化，提供丰富的标签选择，包括His、GST、 FLAG、SUMO等。可提供一系列树脂和磁柱等纯化产品，用于从大肠杆菌、哺乳动物、酵母、昆虫表达系统中纯化重组蛋白。

2. 根据蛋白质分子大小差别的分离

（1）蛋白质膜超滤技术截留蛋白与透析：超滤截留技术一般是指通过利用超高压力场或离散心力，使大分子水凝胶粒子和较少量相对其他载体粒径较小的一点的溶质分子能直接截留通过半透膜，而无需把大分子蛋白质牢固留料在过滤膜片表面上，可实现随意的选择使用各种具有不同的截面孔径类型的过滤膜载体而分别截留于其自身不同孔径的各种分子量类型上的蛋白质。透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。

（2）凝胶过滤法：凝胶网中孔分子的体积大小一定，只允许相应体积大小的小颗粒分子进入到凝胶颗粒网的内部，大部分颗粒被完全排阻在外。溶液分子流经层析柱面时，大点的溶质分子会先随洗脱液子一起从颗粒间隙向内流动沉积下来，小一点的溶剂分子会先在网状结构层流中的洗脱历程长，后被逐渐被洗脱液固定下来。

3.根据蛋白质带电性质进行分离

（1）电泳法：不同种类蛋白质样品在同一溶液pH条件作用下,因样品分子量大小不同以及其携带的电荷数量分布的显著差异等而产生在毛细管电场环境中蛋白质的电子迁移率变化不同结果而分离。

（2）离子交换层析法：离子交换剂主要包括了有阳离子交换剂和有强阴离子交换剂，当需要分离的蛋白缓冲液流经某一个离子交换层析柱表面上时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后就可用适当地改变离子其的pH度值或适当调整离子强度办法来重新将新吸附固定的新的蛋白质从表面上洗脱了下来。

三．常用的蛋白纯化实验流程

1. Ni2+亲和层析纯化His-Tag

Ni2+可以与带有His6标签的融合蛋白结合，也可与咪唑进行结合。当标签蛋白杂质与层析柱表面结构中含有的蛋白杂质和Ni2+发生结合排斥效应时，向它们其中的依次地加入至少两个完全不同比例的相同浓度的咪唑溶液则可以通过自动过滤将所有这些标签蛋白杂质或与其它杂合蛋白的杂质分别准确地加以洗脱后固定沉积下来，从而才能够分离得到相对比较更高纯度的目标蛋白。实验流程如下：

（1）样品准备：样品经超声破碎后，测量蛋白质含量，确定合适的溶液浓度。样品用水中必须保持澄清、无白色细小颗粒物，否则就可能将会出现直接污染堵塞样品柱子、缩短设备正常使用寿命;

（2）先分别用约为5倍柱体积的去离子水洗去约占20%用量的乙醇，再依次分别加入为约占10倍柱体积比例的Binding Buffer平衡柱子;

（3）根据目的蛋白的浓度确定上样体积;

（4）分取约20倍柱体积的Washing Buffer溶液混合洗涤至溶液无蛋白检出，收集所流出液。再加入约20倍柱体积的Elution Buffer洗脱目的蛋白，此步骤可用于设置洗脱梯度;

（5）用5倍柱体积去离子水洗掉缓冲液;

（6）20%乙醇保存于4℃。

2. AKTA系统凝胶过滤层析实验步骤

（1）溶液和样品的准备：纯化所需缓冲液皆要去除工作液中气泡，浓缩后的蛋白需要用0.22 µm的滤膜过滤，低温保存；

（2）开机及清洗：打开电脑及仪器的电源，待AKTATM主机控制面板白灯常亮时则仪器自检完毕后，点击UNICORN软件，进入System control 操作界面。清洗A、B泵完成后自动停止；

（3）预平衡：清洗完成后，将泵头转移到平衡/洗脱缓冲液中，将所用管道的溶液置换为平衡/洗脱缓冲液，直至紫外、电导、柱前压三条基线趋于平稳；

（4）装柱：取下顶部装有乙醇的塞子，拧下系统连接线，将滴出溶液的一端放在柱顶部注入缓冲溶液，滴满后拧到柱上，拧紧顶部的同时松开柱下堵头，防止凝胶由于高柱压而塌陷。当液体从柱下端滴落时，将系统的另一端连接到柱的下端并拧紧；

（5）平衡：将柱内与系统中的溶液全部置换为缓冲液，溶液大概需要走2个柱体积；

（6）上样：使用超纯水和缓冲液多次清洗上样环；

（7）收集蛋白：选择Fraction collection→Peek fractionation，Insert→Feed tube，输入每管收集体积，Insert→Exectue。停止收集时设置Fraction collection→Stop peek fractionation→Exectue。流速控制在0.5~0.8 mL/min；

（8）清洗及卸下层析柱：先用2个柱体积的超纯水清洗层析柱，再换成将1.5个柱体积的20％乙醇保存层析柱。清洗结束将流速调小，按“先下后上”的顺序将柱子封存好；

（9）将出峰图以及原始数据保存后，先关程序再关系统最后关机。

四．柱层析技术在重组蛋白纯化中的应用

柱层析原理是通过将样品固定相装在层析柱内，样品柱中固定的相不同且组分与样品固定相间的吸附的能力不同，使用各种溶剂对被吸附柱上残留的各组分等进行选择性洗脱处理时便会自动发生分离吸附及解析吸附作用，与样品固定相的吸附结合能力相对较弱一些的各组分将先被吸附洗脱而出样品柱，而分离吸附的能力相对较强一点的组分等则在后相被分离洗脱出柱。以此最终达到样品分离与纯化结合的目的。

应用于蛋白分离纯化的层析种类对比：

层析种类	作用机理	优点	缺点
亲和层析	特异性作用	1.高纯度、高回收率、高选择比 2.分辨率准确度高 3.可实现快速分离简化了分离提取工艺步骤 4.能浓缩样品	1..载体设备较昂贵及笨重 2.配基样品纯化制备技术相对复杂困难多 3.机械强度低 4.配基易脱落
离子交换层析	表面电荷	1.可浓缩样品 2.高载量、高回收率、高选择 3.流速大 4.分辨率高 5.易于放大	样品需要在低盐的状态下
疏水作用层析	疏水性	1.可浓缩样品 2.流速大 3.易放大 4.可作为离子交换的有效补充	1.样品需要在高盐的状态下 2.层析时易受外界影响
凝胶层析	分子大小	1.操作简单、对缓冲液无要求 2.分辨率高 3.能连续进行上样，缩短纯化周期4.可估计分子量	1.上样体积小 2.流速慢 3.样品变稀释

五．蛋白纯化技术的应用

1.应用于分离、提纯以及浓缩化学物质；2.提纯、回收利用生产回收废水中的有用物质；3.浓缩、提纯海洋生物提取物；4.浓缩、提纯氨基酸/蛋白质；5.超细粉生产过程中的产品回收。

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