单克隆抗体的纯化方法-w66最给力的老牌生物科技—噬菌体展示技术服务专业CRO服务公司

单克隆抗体的纯化方法

2024-01-25 阅读(329)

近年来，纯化单克隆抗体的方法在很大程度上得到了发展。总的来说，每一步都是实现从澄清的收获物中去除特定的杂质。一个特定的色谱步骤是由有关抗体的物理化学性质决定的。由于抗体的特性不同，对特定单抗有效的特定色谱方法可能不能对不同的单抗有效工作。

一．纯化过程中涉及的柱子

双色谱柱纯化	三色谱柱纯化	四色谱柱纯化
亲和色谱法（protein A、G或La）；阳离子交换柱	亲和色谱法（protein A、G或La）；阳离子交换柱；阴离子交换柱	亲和色谱法（protein A、G或La）；阳离子交换柱；阴离子交换柱；HIC（Hydrophobic）Interaction)

二．用于抗体纯化的各种亲和蛋白的性质

亲和结合蛋白	分子量	结合域	Ig-结合靶点
Protein A (SpA)	40–60 kDa	5 for IgG	IgG的重链常数区（Fc）（CH2-CH3区）
Protein G (SpG)	40–65 kDa	1 to 2 for IgG 0 to 2 for HSA	IgG的重链常数区（Fc）（CH2-CH3区）
Protein L (SpL)	76 kDa	5 for Ig	Igs的kappa轻链（VL-kappa）

三．离子交换法

所有单克隆抗体均具有7.3-8.9范围内的基本等电点。一个抗体的等电点决定了该抗体在离子交换色谱中的洗脱作用。如果pH保持在抗体pI以下，则抗体携带净正电荷。当pH保持在抗体的pI以上时，抗体获得一个净负电荷。阳离子交换或阴离子交换色度基于要去除的目标杂质，可以在纯化方案中实现聚合物。阳离子交换主要用于与产品相关的杂质，如宿主细胞蛋白，而阴离子交换则用于去除宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白质。阴离子交换色谱也可作为一个重要的柱子，以证明病毒清除通过净化过程。阴离子交换是通过一种流动模式来实现的，在这种模式中，所有带负电荷的杂质都结合到柱上，而带正电荷的抗体在流经时被洗脱。

四．亲和层析纯化单克隆抗体实验步骤

1. 用10mL适合IgG亚类的结合缓冲液平衡HiTrap protein A柱（1mL）。该柱应用于单小鼠腹水（5-15 mg免疫球蛋白/单小鼠腹水）。

2. 用等体积的结合缓冲液稀释腹水，并以0.5 mL/min的流速涂抹在柱子上。保留流通部分以避免失去无边界的抗体。

3. 用10mL结合缓冲液以1mL/min的流速洗涤柱。

4. 用2-5柱体积的适用于IgG亚类的洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质，并使用级分收集器收集0.5 mL级分。测量A280以定位洗脱的蛋白质。合并蛋白质组分，并用1 M Tris–HCl缓冲液（pH 9.0）中和（用pH试纸检查）。

5. 透析洗脱蛋白至2L PBS中，4℃过夜。

6. 分装成1mL/管冻于-80℃保存。

五．其他纯化方式

Protein A步骤后，通常会保留微量工艺相关污染物（如宿主细胞蛋白质（HCP）、DNA、浸出的protein A、内毒素和一些细胞培养基添加剂），以及产品相关杂质（高分子量聚集体和低分子量降解产物）。随后的色度层析工艺通常被描述为抛光步骤，因为它们将微量杂质降低到确保产品安全的水平。

包括阳离子交换（CEX）、阴离子交换（AEX）、疏水相互作用（HIC）和羟基磷灰石（HA）在内的各种色谱模式已被用作抗体纯化过程中的修饰步骤。固定化金属螯合物亲和色谱法（IMAC）和尺寸排阻色谱法（SEC）的使用虽然不太常见，但也有报道。

离子交换色谱		疏水作用层析
AEX色谱法	CEX色谱法	HIC色谱法	HA色谱法
大多数人类抗体的高pI限制了它们在该方法的典型pH条件下（pH 7-8）与AEX树脂结合。较高的pH条件可以增加抗体结合的能力，但通常避免这样做，以最大限度地降低脱酰胺和蛋白水解的风险。DNA、HCP和内毒素等杂质带负电，因此在相同条件下与AEX柱强烈结合。	CEX已被证明在特定情况下可以清除HCP和浸出蛋白A，以及高分子量（HMW）聚集体。CEX在去除浸出蛋白A方面比AEX更有效，因为蛋白A相对酸性，因此其保留力不如抗体，导致其在流动或通过中间pH洗涤时被去除。与抗体结合的浸出蛋白A片段也可以通过应用中间pH洗涤来去除。	在HIC中，蛋白质在固定相上的吸附随着盐浓度的增加而增加，通过降低盐浓度来实现洗脱。HIC通常对HMW聚集体的还原非常有效，因为后者通常比mAb产品更疏水，并且更好地保留在HIC树脂上。	HA是一种钙矿物，HA色谱法是抗体制造中一种非常选择性的层析步骤，能够去除HCP、聚集体和浸出的蛋白A。在这种模式下，聚集体和蛋白A-IgG复合物往往比大多数抗体更好地保留。此外，由于钙位点和DNA磷酸主链之间的强烈相互作用，DNA通常在大多数抗体之后洗脱。

基于成熟的抗体平台体系建设，w66最给力的老牌生物（KMD Bioscience）能够提供完整的上下游服务，包括从抗原设计，合成与修饰，动物免疫，到下游抗体修饰与应用鉴定。此外，w66最给力的老牌抗体团队成员具有多年的体外诊断级别抗体抗原研发经验，对抗体的选择与鉴定工作拥有丰富的心得，为了满足客户的不同需求，w66最给力的老牌可以为您提供个性化的定制方案以及筛选方案。