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步骤名称

主要操作

实验准备

免疫原、弗氏佐剂、弗氏不完全佐剂、生理盐水、注射器

6-8周龄雌性Balb/C小鼠、酶标板、抗鼠酶标二抗

免疫方案的设计

总体积：每只小鼠200μL；免疫原量：每只鼠每次20μg；佐剂注射量：每只鼠每次100μL佐剂。每两周注射一次，4次后取血检测效价，达到10⁵可融合，融合前加强免疫一次。（初次免疫用弗氏完全佐剂，其余用弗氏不完全佐剂。）

效价检测

间接ELISA，将已知抗原吸附于固相载体上，形成固相抗原，用酶标记抗抗体，检测标本中的抗体 。

（1）包被：待测抗体/抗原对应的抗原/抗体进行包被，浓度100ng/well，每孔100μL。Eg：1板（100孔），需要100ng*100=10μg，吸取浓度为1.0mg/mL体积10μg/1.0mg/mL=10μL于10mLCBS缓冲液，4度过夜。

（2）洗板：洗板机PBST，300μL/well，3遍。

封闭：PBST配1%BSA，200μL/well，室温封闭1h。

洗板：洗板机PBST，300μL/well，3遍。去多余的BSA。

（3）一抗标记：待检测抗体或抗原，100μL/well，室温2h。

（4）洗板：洗板机PBST，300μL/well，3遍。

（5）酶标二抗：HRP-IgG辣根过氧化物酶标二抗或其他二抗，使用前1%BSA稀释，100μL每孔，室温1h。

（6）洗板：洗板机PBST，300μL/well，3遍。

（7）显色：TMB，50-100μL每孔12min室温。

（8）终止：1M H₂SO₄，每孔50-100μL。

（9）读数：酶标仪OD450读数。

取饲养层细胞

小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb/c小鼠6～10周龄。

（1）拉颈处死，浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟。

（2）用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。

（3）用无菌注射器注入6～8mL培养液。

（4）反复冲洗，吸出冲洗液。

（5）放入10mL离心管，1200转/分离心5～6分钟。

（6）用20％小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数1×10^５/mL。

（7）加入96孔板，100μL/孔。

（8）放入37℃ CO₂孵箱培养。

　　一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×10⁶腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×10⁶/mL，小鼠脾细胞为1×10⁶/mL，小鼠的成纤维细胞（3T3）1×10⁵/mL，均为100μL/孔。

取脾细胞与骨髓瘤细胞融合

骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。

（1）取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

（2）同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

（3）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50mL塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟。

（4）弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

（5）轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

（6）在室温下融合:

①30秒内加入预热的1mL 45％PEG（Merek，分子量4000）含5％DMSO，边加边搅拌。

②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1mL，2mL，3mL，4mL，5mL和10mL。

④离心，800rpm，6分钟。

⑤弃上清，先用6mL左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

⑥根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10mL一块96孔板。

⑦将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μL/孔，37℃、5％CO₂孵箱培养。一般一块96孔板含有1×10⁷脾细胞。

HAT选择杂交瘤

一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。

抗体的检测

筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

杂交瘤的克隆化

（1）制备饲养细胞悬液（同融合前准备）。

（2）阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10^３/mL。

（3）取130个细胞放入6.5mL含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/mL，100μL/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9mL细胞悬液补加2.9mL含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/mL，100μL/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2mL细胞悬液补加2.2mL含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/mL，100μL/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。

（4）培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μL/孔。

（5）第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。 注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

　杂交瘤的冻存

杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。

单克隆抗体的大量生产

1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg/mL，如果大量生产，费用较高。

2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

①实体瘤法　对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×10⁷/mL接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 mL， 共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg/mL。但采血量有限。

②腹水的制备　常规是先腹腔注射0.5mL Pristane（降植烷）或液体石腊于BaLb/c鼠，1～2周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10mL腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/mL， 这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。

抗体的纯化

（1）将ProteinA柱料进行装柱，1mL柱料约能纯化出10mg抗体。

（2）替换：使用15倍柱体积纯化水替换层析柱中20%乙醇保护液。

（3）平衡：使用15倍柱体积磷酸盐平衡缓冲液进行平衡。

（4）上样：样品上样前应进行滤膜过滤，循环上样3次，使抗体与柱料结合。

（5）再平衡：使用15倍柱体积磷酸盐缓冲液平衡，洗去未结合蛋白。

（6）洗脱：使用5倍柱体积甘氨酸洗脱液进行抗体洗脱。

（7）洗脱后，洗脱液为纯化的抗体，用中和液进行pH调节。

（8）柱子使用后，先用磷酸盐缓冲液替换甘氨酸，再用纯化水替换磷酸盐缓冲液，最后用20%乙醇进行保存柱料。

（9）纯化的抗体使用蛋白含量检测仪进行浓度检测。

抗体的鉴定

（1）参照分离胶的配制方案配制不同浓度的分离胶和浓缩胶。将分离胶注入玻璃板夹层中，上部用纯化水封面，保持胶面平整，待分离胶聚合后，配制浓缩胶。

（2）配制好浓缩胶后，倒去分离胶表面的少量水分，然后灌入浓缩胶，插入点样梳。

（3）非还原性丙烯酰胺凝胶电泳

取电泳样品用纯化水稀释至每孔上样总量为5ug，若与4×非还原SDS-PAGE上样缓冲液以7.5 uL+2.5 uL体积混合。

（4）还原性丙烯酰胺凝胶电泳

取电泳样品用纯化水稀释至每孔上样总量为5ug，若与5×还原SDS-PAGE上样缓冲液以8 uL+2 uL体积混合，置于100℃水浴中加热10min。

（5）将梳子拔出，即可上样，蛋白Marker标准品上样5uL。

（6）接通电源，恒压80-100V浓缩胶，120-150V分离胶。

（7）取出凝胶，切掉浓缩胶，于玻璃皿中，加纯化水加热至煮沸后停止，弃水。

（8）染色：加入20mL-25mL快速染液（漫过胶面），加热至沸腾后保持8分钟，回收染色液。

（9）脱色：加入适量纯化水加热沸腾后5min，换水重复2-3次。

（10）通过凝胶成像系统照相观察结果，并保存。