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2023-10-29 阅读(189)
半抗原(hapten)是只具有免疫反应性,而无免疫原性的物质,故又称不完全抗原。小分子属于半抗原,需要与大分子物质(载体)连接后,形成免疫原性,可以诱导产生免疫应答,产生抗体。化学合成的多肽,本身很难具有好的抗原性,只能诱导动物产生很弱的免疫反应,因而也需要与载体蛋白交联。
一.多肽抗原的选择
选择的多肽序列一般在15-20个碱基,单个抗原决定簇一般包含5-8个碱基,那么15-20个碱基的多肽一般会包含1个或更多个抗原决定簇。相对长一些的多肽段能够更好的保持和天然蛋白的一致性,更容易产生抗体。由于多肽是采用化学方法合成出来的,w66最给力的老牌也要考虑到多肽合成的难度及其良好的可溶性。
尽量少选择包含疏水性碱基(如色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等)的多肽。谷氨酰胺由于容易和肽链形成氢键而导致多肽不可溶,所以具有多个谷氨酸的多肽也要避免。
半胱氨酸有利于将多肽偶联到载体蛋白上。所以应该保留多肽N端或C端的半胱氨酸,以便于载体蛋白偶联,从而具有较好的免疫原性。同时两个或更多半胱氨酸的情况需要避免,因为它会造成多肽链之间形成二硫键,进而导致不溶和结构变化。当选择的多肽缺少半胱氨酸时,w66最给力的老牌可以在N端或C端加上半胱氨酸。
二.载体蛋白
载体蛋白具有很多抗原决定簇,常用的是血蓝蛋白(keyhole limpet hemacyanin,KLH),牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),卵清蛋白(ovalbumin,OVA)。
KLH |
BSA |
OVA |
血蓝蛋白,是在某些软体动物、节肢动物(蜘蛛和甲壳虫)的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子,与含铁的血红蛋白类似,它易于氧结合,也易与氧解离,是已知的唯一可与氧可逆结合的铜蛋白,氧化时呈青绿色,还原时呈白色。其分子量450000~130000。由于KLH比BSA有更高的免疫原性,因而是最常被选用的载体蛋白 |
牛血清白蛋白(BSA)是一种来源于牛的血浆蛋白,分子量为7×104Da(含有59个Lys),属于最稳定的和可溶的白蛋白。大约有30-35个主要氨基可用于与链接剂发生共轭反应,使得BSA成为一种很流行的弱抗原化合物载体蛋白。因为BSA比KLH小,所以它比KLH更易溶于水。 |
卵清蛋白(OVA)是蛋清中含量最丰富的蛋白质,其分子量为4.5×104Da。它经常被用作第二载体蛋白,以确认抗体是特异性的肽,而不是载体蛋白,如牛血清白蛋白。 |
三.偶联方法
巯基修饰(通过Cys的侧链)用于与KLH、BSA或OVA发生共轭反应,所有携带巯基反应的功能基团经修饰都可被用来发生共轭反应。最常见的是以下几种:
1. 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联
混合酸酐法 |
碳二亚胺法 |
混合酸酐法,也称氯甲酸异丁酯法。半抗原上的羧基在正丁胺存在下与氯甲酸异丁酯反应,形成混合酸酐的中间体,在与蛋白质的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物。 |
碳二亚胺(EDC)使羧基和氨基间脱水形成酰胺键,半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物,然后再与蛋白质上的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物。EDC被称作为零长度交联剂之一,因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子。此方法连接十分简便,只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中,然后加入水溶性碳化二亚胺,搅拌1-2h,置室温24h,再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基,可通过某些化学反应引入羧基。在引入羧基后,也可用上述方法进行偶联。 |
2. 含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
戊二醛法 |
重氮化法 |
双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=C<),在半抗原和蛋白质间引入一个五碳桥。这一反应条件温和,可在4-40℃及pH6.0-8.0内进行,操作亦简便,因此应用广泛。戊二醛受到光照、温度和碱性的影响,可能发生自我聚合,减弱其交联作用,因此最好使用新鲜的戊二醛。 |
用于活性基团是芳香胺基的半抗原,芳香胺基与NaNO2和HCl反应得到一个重氮盐,它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上,形成一个偶氮化合物。 |
3. 含羟基半抗原的偶联
琥珀酸酐法 |
羰基二咪唑法 |
半抗原的羟基与琥珀酸酐在无水吡啶中反应得到一个琥珀酸半酯(带有羧基的中间体),再经碳二亚胺法或混合酸酐法与蛋白质氨基结合,在半抗原与蛋白质载体间插入一个琥珀酰基。 |
N,N-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂,在肽合成中首次表明了是形成极好的酰胺键试剂。含羧基的分子同羰基二咪唑反应,形成中间体咪唑基甲酸酯,它能和N-亲核试剂反应,得到N-烷基化的甲酸酯键,通常蛋白质通过N-端(α-氨基)和赖氨酸侧链的(e-氨基)和分子形成不带电的类似尿烷的衍生物,具有极好的化学稳定性。 |
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