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ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。ELISA检测是实验室中常见的定性和定量方法，本文将从两个方面探索ELISA实验中关于阴性阳性对照以及影响ELISA实验结果的因素方面进行探讨和讨论。

图1 ELISA检测实验

一、ELISA中设置空白、阴、阳性对照的作用

1．空白对照：反映实验的背景噪声。仅用稀释液代替检测样本、用以观测最终反应的显色“本底”、并用于酶标仪消除、扣除“本底”，即：以本底为“零”读取阳性、阴性对照孔和样本检测孔的吸光值（A）。

2．阴性对照：为了排除假阳性，以及提供阴性结果的参照值。阴性对照是在检测试验中采用与待检物具有同源性和同质性，又不含有待检物质，并能客观比较和鉴别处理因素（血清免疫学试验中有特异性抗原与抗体反应）之间的差异的对照样品。

3．阳性对照：为了排除假阳性，以及提供阴性结果的参照值。阳性对照是采用“精选”的含有待检物质的样品。所谓“精选”，就是把收集的阳性人血清经过数种试验进行“筛试”、把含有“干扰性物质”的血清剔除、不用，以避免出现“假阳性”干扰试验结果。

二、影响ELISA实验结果的因素

1．样品：样品是检测的前提，样品质量会直接影响实验结果。可以用ELISA来检测的样品很多，根据检测项目不同可以是血清、全血、唾液、尿液等，但大部分还是以血清为样品。作为血清样品，应避免溶血，溶血可能会增加非特异性显色，导致结果出现误差。血清样品的反复冻融会使血清中的抗体效价下降，所以需要多次检测的血清样品，如在5d内检测完，可4℃保存，如需长时间检测，可进行分装冻存。样品如被细菌污染腐败，可能会导致假阳性。

2．温度和时间：抗原和抗体反应需要适宜的温度和反应时间，温度和时间是ELISA反应中最重要的条件。温度控制主要在试剂盒使用前一定要提前半小时左右取出，恢复至工作温度，恒温箱要提前打开，设定到反应温度，以保证反应速度。在温度保证的前提下，时间的控制至关重要，尤其是底物显色的时间控制，显色时间不足或过长会导致实验不成立，无法对检测结果进行判断。

3．人员操作：ELISA成品试剂盒为检测工作提供了方便，按照说明书进行操作就可以完成实验，但人为操作时候很多细节也会导致实验误差。

（1）包被一些ELISA反应板需要自行进行包被处理，没有进行包被，或包被液使用与检测项目不同都会使实验失败。包被时，未进行震荡，孔底未被包被液全部覆盖会导致检测结果偏差。

（2）反应液稀释稀释液使用错误或稀释比例不正确会导致实验失败或结果不准确。

（3）洗板人工洗板时，弃去洗涤液时方法不当，易使各孔液体相互流入，导致假阳性；洗涤液使用量和洗涤次数过少导致洗涤不彻底，洗板后未拍板或拍不干净都会影响实验结果。

（4）其他封板膜封闭不严或开启时孔内液体蒸发、震出可导致各孔相互污染；操作时接触到ELISA板底导致透光度改变，影响酶标仪测量结果；加样时未注意移液器吸头堵塞或漏气导致加液量不准确；加不同试剂时未更换吸头等。

4．设备：仪器设备是ELISA实验的基础，常用的相关仪器设备包括移液器、酶标仪、洗板机和恒温箱等。所有设备都需要进行检验校准，保证准确性和精确度。移液器的使用要尽可能选择所需加液量接近最大量程，并正确使用，减少实验误差；酶标仪要提前开机预热，保证光源稳定；洗板机要检查加液孔是否通畅，保证加液量；恒温箱要提前开机，开、关门要快速，保证反应温度。5试剂试剂盒要根据要求进行保存，并保证在有效期内使用，使用前应平衡到室温。新购入的试剂盒要进行校验，检查实验是否成立，不同的试剂盒或不同批号的试剂不可混用。

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