周一至周六
8:00-18:00
2023-07-14 阅读(281)
Fab片段是抗体结构中可以与抗原结合的区域,也叫做抗原结合片段,涉及到抗体-抗原结合的亲和力,抗体特异性等特征。抗体Fab片段含有1个可变区(V区)和1个恒定区(C1),V区含有3个互补决定结构域(CDR),涉及到独特型抗体的产生,抗体的超频突变,尤其是CDR3结构域是抗体工程改造的核心区域;C1区主要起结构支撑作用。
图1:fab抗体示意图
重组Fab的优势比较明显,由于不具备Fc区,从而不需要翻译后修饰和糖基化,可以同时在原核和哺乳动物系统中表达。生产Fab片段,通常利用大肠杆菌表达系统与哺乳动物表达系统。大肠杆菌表达系统具有生产成本低、生产速度快等优点,但容易形成包涵体,复性后活性难保证。
表1:fab抗体与scfv抗体区别
区别 |
Fab |
scFv |
构成 |
VH、CH1、VL、CL |
VH、VL |
分子量(kDa) |
55 |
25 |
肿瘤渗透性 |
良好 |
较强 |
稳定性 |
长期储存时稳定性高 |
储存时间较长时不稳定 |
亲和力 |
很高 |
较高 |
Fab类抗体片段具有分子质量小、组织分布特异性强、免疫原型低、可基因工程操作等特点,使Fab成为了医药研究领域的重要成员之一,Fab类药物在预防、诊断、治疗等领域有着广泛的应用,例如:已经上市的赛妥珠单抗酯(一种Fab片段,Cat:YR1612),可以有效地针对类风湿性关节炎;作为Fab片段的美妥昔单抗I也已经用于治疗肺癌等。
w66最给力的老牌生物(KMD Bioscience)多年来致力于抗体领域研究。w66最给力的老牌积累了丰富的抗体文库构建经验,能够为客户提供基于抗体噬菌体展示文库技术的fab抗体文库构建服务。
w66最给力的老牌生物为客户提供fab噬菌体文库构建服务,流程包括:抗体cDNA制备,基因扩增,载体构建,电击转化,抗体鉴定,fab文库包装。
图2:fab噬菌体展示抗体库构建流程
客户提供人外周血淋巴细胞,淋巴结细胞或脾脏细胞(保存在RNA later等溶液中,避免RNA降解,蓝冰运输),EBV病毒单克隆化。
将外周血淋巴细胞从冰箱取出后分装,加入氯仿,离心后取上清加入异丙醇,离心保留沉淀,加入75%乙醇后离心保留沉淀,干燥后加入DEPC水,孵育确保RNA溶解,将各管混合到一管中即为总RNA,取总RNA进行电泳,取总RNA用核酸浓度测量仪测浓度。
按照商业化试剂盒操作说明书进行cDNA制备,将上一步得到的RNA反转录成cDNA。
以cDNA为模板扩增抗体重链(Fd段)和轻链可变区基因。
图3:Fd和轻链PCR扩增结果
PCR 扩增的 Fd 片段产物(通过琼脂糖凝胶电泳分离)用过量的限制酶切割,通常约350ng与2μg Xho/Spe I 线性化的 pComb3 载体(通过分离琼脂糖凝胶电泳)在150μL 的总体积中与连接酶在 16℃下反应 15小时,命名为P+Fd。PCR扩增的轻链片段产物和重组的p+Fd(琼脂糖凝胶电泳分离)用过量的限制酶切割,连接、转化,将具有Fd和κ轻链的噬菌粒命名为pComb3H +κ+ Fd。
取大肠杆菌感受态细胞,加入回收后的连接产物,将混合后的感受态细胞和连接产物转移到预冷好的电转杯中,使用电转仪预设的转化程序电击转化,电转后立即往电转杯中加入培养基,至少进行20个电转。将细胞复苏后涂在琼脂糖培养板上过夜生长。将上一步过夜生长后的培养板上的细胞用培养基和涂布棒冲洗刮下,加入甘油测OD600nm值后保存在-80℃,即为细菌文库。
6 孔板(Nunclon™)用等量的外周血淋巴细胞包被 5×106 个细胞,然后在4℃下用 BSA/PBS 封闭过夜。每孔加入 1 ml 噬菌体文库,37℃孵育 2 h。对于第 1、2、3、4 和 5 轮,分别用 TBS/ 吐温 20 (TBST) 洗涤未结合的噬菌体 1、5、10、10、10 次。通过添加洗脱缓冲液(0.1 M HCL,用固体甘氨酸调节至 pH 2.2 并含有 0.1% BSA)洗脱结合的噬菌体,并用 2 M Tris 缓冲液,pH 8.0 中和洗脱溶液。如上所述遵循 VCSM13 辅助噬菌体的扩增程序,同时在 LB-氨苄青霉素平板上滴定输入和输出噬菌体。噬菌体结合、洗脱和扩增步骤进行5轮。
随机挑选20-50个克隆,PCR鉴定阳性率,测序和分析抗体序列。
图4:阳性率:>90%
交付>1x1013噬菌体颗粒/ml。
传统的杂交瘤技术生产单克隆抗体成本高,而且产生的鼠源抗体往往具有触发人抗小鼠抗体(HAMA)反应的缺点。因此,通过噬菌体展示技术产生的重组 Fab 抗体可以成为治疗肿瘤的合适替代方案。w66最给力的老牌生物为您提供的人源Fab抗体文库构建服务亲和力高,库容量高,独立克隆数107-1012,根据客户需求制备,为每一个客户量身定制实验方案。