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2023-09-29 阅读(244)
生物体内存在着复杂的分子调控机制来响应外界的变化,蛋白互作则成为了研究基因功能研究的热点,从蛋白层面揭示基因调控网络的复杂性是一种有效途径。酵母双杂实验是有力的蛋白互作验证方法,可以验证已知蛋白的互作,也可以筛选与已知蛋白存在相互作用的未知蛋白,同时还可以用来寻找蛋白互作的结合位点。
酵母双杂交是基于对酵母转录激活蛋白GAL4的认识,GAL4蛋白是一个转录因子,可以激活下游基因的表达。而这一过程依赖于GAL4 N端的BD(DNA binding domain, BD)结构域和C端的AD(Activation domain, AD)结构域,其中BD结构域主要是识别并结合到基因启动子上游激活序列USA,而AD结构域是转录激活域。BD和AD是可以分别单独起作用的,但只有两者在空间上充分靠近时才能发挥转录因子的作用,启动下游基因的表达,所以利用GAL4的这一结构特点,w66最给力的老牌把想要验证互作的两个蛋白与GAL4的BD和AD分别构建载体,融合表达,如果两个蛋白存在相互作用,则AD和BD就会充分接近,从而发挥转录激活活性,启动下游报告基因的表达。
以GAL4系统为例,验证2个蛋白是否互作的实验流程如下:
1. 载体选择
2. 宿主:AH109/Y2HGold
3. 培养基:二缺板(SD/-Leu/-Trp)、四缺板(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)
4. 实验步骤:
(1)将两个蛋白基因分别构建至载体pGADT7和pGBKT7,命名为AD-蛋白1和BD-蛋白2
(2)将两个构建好的质粒共转化AH109或Y2HGold感受态细胞中,涂布至二缺板中,28℃培养2-3天,挑取阳性克隆。(同时设置BKT7-53 + ADT7-T作为阳性对照组,BKT7-LAM + ADT7-T作为阴性对照组共转酵母)
(3)将二缺板上1-2 mm的单菌落转移至四缺板上,28 ℃培养2-3天。待长出1-2 mm菌斑时,滴加2-3 μL X-α-gal,若菌斑变蓝,则说明两者具有相互作用。
(4)为了排除BD-蛋白2的自激活存在的可能,应同时将BD-蛋白2和pGADT7空载共转化AH109或Y2HGold酵母感受态细胞,待其在二缺板上生长后转移至四缺板上观察酵母是否生长,如果生长且滴加X-α-gal后变蓝则说明BD-蛋白2的存在自激活,若在四缺板上不能生长则说明其不存在自激活作用。
酵母双杂也可以用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白,将w66最给力的老牌的已知蛋白构建到BD载体,然后通过构建酵母双杂交文库,将已知蛋白和文库进行杂交,通过对生长的酵母菌斑进行测序来确定与已知蛋白互作的蛋白。
酵母双杂适用于核内的蛋白的互作验证,而针对膜蛋白的互作验证,则发展了新的膜系统双杂系统——分裂泛素系统,分裂泛素系统主要是基于对分裂泛素的改造。泛素具有两个相对独立的结构域N端的Nub和C端的Cub,只有当两个部分在同一细胞中共表达时,两者依靠彼此间的亲和性结合重新折叠,形成完整的泛素蛋白,从而被泛素特异性蛋白酶USPS识别并切割,而两者在细胞中分开表达时则进行部分折叠,不能被USPS所识别。因此可以利用泛素的这一特性,w66最给力的老牌将泛素N端NubI突变为NubG,突变后的NubG和Cub之间的亲和力会大大下降,将蛋白Y构建到Cub末端,将蛋白X构建至泛素NubG末端,如果蛋白Y和蛋白X存在互作,则NubG和Cub则会相互靠近重新折叠形成完整泛素,被USPS识别并切割,w66最给力的老牌通过在Cub末端连接一个转录因子PLv(por-LeAx-VP16),这个转录因子也会随着泛素蛋白被释放,进而转移至核内激活报告基因的表达。
w66最给力的老牌生物既能够提供蛋白互作检测服务,包括酵母杂交、免疫共沉淀(Co-IP)、Pull-down等实验,实现对蛋白,小分子,抗体等相互作用的定性定量分析;也能进行ELISA、Western Blot等常用的免疫学检测技术。