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生物体内存在着复杂的分子调控机制来响应外界的变化，蛋白互作则成为了研究基因功能研究的热点，从蛋白层面揭示基因调控网络的复杂性是一种有效途径。酵母双杂实验是有力的蛋白互作验证方法，可以验证已知蛋白的互作，也可以筛选与已知蛋白存在相互作用的未知蛋白，同时还可以用来寻找蛋白互作的结合位点。

酵母双杂交是基于对酵母转录激活蛋白GAL4的认识，GAL4蛋白是一个转录因子，可以激活下游基因的表达。而这一过程依赖于GAL4 N端的BD（DNA binding domain, BD）结构域和C端的AD（Activation domain, AD）结构域，其中BD结构域主要是识别并结合到基因启动子上游激活序列USA，而AD结构域是转录激活域。BD和AD是可以分别单独起作用的，但只有两者在空间上充分靠近时才能发挥转录因子的作用，启动下游基因的表达，所以利用GAL4的这一结构特点，w66最给力的老牌把想要验证互作的两个蛋白与GAL4的BD和AD分别构建载体，融合表达，如果两个蛋白存在相互作用，则AD和BD就会充分接近，从而发挥转录激活活性，启动下游报告基因的表达。

以GAL4系统为例，验证2个蛋白是否互作的实验流程如下：

1. 载体选择

2. 宿主：AH109/Y2HGold

3. 培养基：二缺板（SD/-Leu/-Trp）、四缺板（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）

4. 实验步骤：

（1）将两个蛋白基因分别构建至载体pGADT7和pGBKT7，命名为AD-蛋白1和BD-蛋白2

（2）将两个构建好的质粒共转化AH109或Y2HGold感受态细胞中，涂布至二缺板中，28℃培养2-3天，挑取阳性克隆。（同时设置BKT7-53 + ADT7-T作为阳性对照组，BKT7-LAM + ADT7-T作为阴性对照组共转酵母）

（3）将二缺板上1-2 mm的单菌落转移至四缺板上，28 ℃培养2-3天。待长出1-2 mm菌斑时，滴加2-3 μL X-α-gal，若菌斑变蓝，则说明两者具有相互作用。

（4）为了排除BD-蛋白2的自激活存在的可能，应同时将BD-蛋白2和pGADT7空载共转化AH109或Y2HGold酵母感受态细胞，待其在二缺板上生长后转移至四缺板上观察酵母是否生长，如果生长且滴加X-α-gal后变蓝则说明BD-蛋白2的存在自激活，若在四缺板上不能生长则说明其不存在自激活作用。

酵母双杂也可以用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白，将w66最给力的老牌的已知蛋白构建到BD载体，然后通过构建酵母双杂交文库，将已知蛋白和文库进行杂交，通过对生长的酵母菌斑进行测序来确定与已知蛋白互作的蛋白。

酵母双杂适用于核内的蛋白的互作验证，而针对膜蛋白的互作验证，则发展了新的膜系统双杂系统——分裂泛素系统，分裂泛素系统主要是基于对分裂泛素的改造。泛素具有两个相对独立的结构域N端的Nub和C端的Cub，只有当两个部分在同一细胞中共表达时，两者依靠彼此间的亲和性结合重新折叠，形成完整的泛素蛋白，从而被泛素特异性蛋白酶USPS识别并切割，而两者在细胞中分开表达时则进行部分折叠，不能被USPS所识别。因此可以利用泛素的这一特性，w66最给力的老牌将泛素N端NubI突变为NubG，突变后的NubG和Cub之间的亲和力会大大下降，将蛋白Y构建到Cub末端，将蛋白X构建至泛素NubG末端，如果蛋白Y和蛋白X存在互作，则NubG和Cub则会相互靠近重新折叠形成完整泛素，被USPS识别并切割，w66最给力的老牌通过在Cub末端连接一个转录因子PLv（por-LeAx-VP16），这个转录因子也会随着泛素蛋白被释放，进而转移至核内激活报告基因的表达。

w66最给力的老牌生物既能够提供，包括、、等实验，实现对蛋白，小分子，抗体等相互作用的定性定量分析；也能进行、等常用的免疫学检测技术。