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基因过表达（gene overexpression）是将目的基因编码区序列（CDS）克隆到相应的质粒或病毒载体上，利用载体骨架上构建的调控元件，使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，从而实现目的基因的过表达。此外，还可选择报告基因进行示踪或抗性基因进行筛选。

过表达技术可以用于筛选新的基因功能和标靶药物，常用的病毒载体有腺相关病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体等，广泛应用于体外和体内基因功能研究。

一．DNA重组技术进行基因过表达实验步骤

1.扩增目的基因：将含有目的基因的载体与慢病毒载体进行LR重组反应。采用8μL体系，其中pENTR 3c dual 100 ng、pLenti6.3/V5-DEST 1 μL、LR重组酶混合物2 μL、补加TE缓冲液至8μL，置于25C水浴锅，过夜，培养12-16h。然后将过夜培养的重组质粒1μL加入10μL的TOP10感受态中进行转化、挑克隆、摇菌。

2.目的基因与真核表达载体的重组连接：提取质粒并进行酶切验证所得质粒是否准确导入目的基因。采用20μL酶切体系对目的片段进行酶切；酶切后的基因片段进行琼脂糖凝胶电泳，将含有目的基因的凝胶回收；回收所得目的基因与pcDNA 4.0进行重组连接。取pcDNA 4.0、目的基因、连接酶，16°C放置10 h；将全部连接产物加入100 μL Top10感受态做转化；所得产物进行酶切后通过琼脂糖凝胶电泳验证。

3.序列测定：挑取阳性克隆，提取目的基因进行NCBI-blast匹配检测序列，排除重组过程中对的基因突变。

4.细胞转染：将重组成功的真核表达质粒载体pcDNA4.0-14-3-3θ转染293T细胞。将2x 10个293T细胞于前一晚铺于6 cm平皿中;用Lip2000 15 μL、重组真核表达质粒6 μL和无血清的培养液进行转染；6h后换含10%血清的培养液，72h后收蛋白，采用western-blot进行目的蛋白高表达的验证。

5.过表达目的蛋白的细胞株的筛选与验证：将含有目的基因的重组质粒和pcDNA4.0-cherry分别细胞。转染体系和条件与上述转染过程相同，转染72 h后用含zeocin 100 μg/mL的培养液进行筛选，三周后所得细胞克隆提取蛋白，用western-blot进行目的蛋白水平高表达的验证；提取RNA，进行Real-time RT-PCR进行mRNA水平蛋白高表达的验证。

二．CRISPRa基因过表达技术

2.1 技术原理

CRISPRa系统通过在sgRNA与Cas9蛋白之间连接一个转录激活域，使其靶向特定的启动子区段或增强子区域，上调基因的转录活性，实现基因表达的激活。

2.2 关键要素

CRISPRa系统主要是由特异性sgRNA和Cas9-转录激活域融合蛋白构成，转录激活域通常选用VP64或p65AD等，通过连接子与Cas9 C端链接。sgRNA设计需要选择靶基因的启动子或增强子区段。CRISPRa方法一般适用于不能直接外源过表达的大基因。

2.3 实验步骤

（1）构建Cas9-激活域融合表达载体和sgRNA表达载体；

（2）转染表达载体到细胞中，实现CRISPRa在细胞内的表达；

（3）提取RNA，使用qPCR判断靶基因mRNA表达量的变化，确认基因激活效果。

（4）相较于对照组，靶基因mRNA水平显著上调，则实验成功。

三．CRISPRa与ORF传统过表达技术的对比

四．过表达三类载体的特点及适应性

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