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2023-04-07 阅读(1209)
蛋白纯化是利用蛋白间的相似性与差异性来进行的。利用蛋白间的相似性来去除非蛋白物质;利用蛋白的差异性将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。关于可溶性蛋白与包涵体蛋白一般是原核表达中涉及的概念。可溶性蛋白指可以以小分子状态溶于水或其他溶剂的蛋白。包涵体是外源基因在原核细胞中表达时(尤其在大肠杆菌中高效表达时),形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒。包涵体通常在细胞质中形成;如果使用分泌载体,它们可以在周质空间形成。
细胞中的生物学活性蛋白质常以可溶性或分子复合物的形式存在,功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体,不具有生物学活性。包涵体形成与胞质内蛋白质生成速率有关,新生成的多肽浓度较高,无充足的时间进行折叠,从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体;此外,包涵体的形成与宿主菌的培养条件有关,如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素。
1. 原核表达重组蛋白提取
根据蛋白表达方式来收集培养基上清(分泌表达)或者是菌体(胞内或周质空间表达),培养基上清表达的情况较少,收集到的菌体使用一定的缓冲液重新悬浮起来,悬浮起来后进行破碎处理,破碎方式有超声破碎、高压均质,如果是周质空间表达的话,可以通过渗透压、反复冻融的方式让蛋白充分释放;处理完成后需要进行离心,离心后分离上清液和沉淀(包涵体)。
其中,收集的培养基上清(分泌表达)和离心后分离的上清均为可溶性蛋白;离心后得到的沉淀为包涵体蛋白。
2. 可溶性蛋白纯化策略-CIPP纯化策略
首先明确需求,根据需求选择合适的纯化策略。
层析纯化领域最为经典就是由Cytiva提出的CIPP(Capture, Intermediate Purification, Polishing)纯化策略。该理论认为生物大分子的纯化需要在分辨率(Resolution)、速度(Speed)、载量(Capacity)和回收率(Recovery)之间取得平衡。
主要步骤为:
Capture(捕获):分离、浓缩和稳定目标产物,去除主要杂质;
Intermediate Purification(中间纯化):将大量杂质去除;
Polishing(精纯):最困难的纯化步骤,去除难以去除的杂质,得到高纯度产物。
CIPP纯化策略中各层析技术使用频率
纯化方法 |
Caption |
Purification |
Polishing |
特点 |
亲和层析(AC) |
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特异性好,但是很难去除同样敏感的杂质 |
离子层析(IEX) |
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对起始电导有要求 |
疏水层析(HIC) |
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高盐上样、受温度影响较大、收率偏低 |
反向层析(RPC) |
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使用方式pH极端或有机溶剂,导致蛋白失活 |
分子筛(SEC) |
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上样体积受限、流速受限、时间长、寿命短 |
3. 包涵体蛋白纯化策略
包涵体样品变复性处理:前期预处理、包涵体溶解、复性。
前期预处理:
菌体破碎(超声破碎、高压均质)
包涵体洗涤,去掉一定的脂质、膜蛋白、杂蛋白
缓冲体系:PB、PBS、Tris
去污剂:Tween20、Trition X-100
添加剂:尿素、EDTA、盐酸胍
包涵体溶解:
Buffer:PB、PBS、Tris
溶解试剂:8M 尿素、6M 盐酸胍、7M 盐酸胍
还原剂:DTT、β-ME、TCEP
洗涤剂:SDS、CHAPS、N-lauroylsarcosine
极端pH:低、高
纯化变性蛋白方式:亲和纯化、离子纯化、分子筛纯化、反向纯化
包涵体复性:
复性缓冲液:参考文献、广谱筛选
复性方法:稀释(透析属于稀释)、柱上复性
复性条件:浓度、温度、搅拌速率、时间、换液(及换液方式)