是通过将转移载体中的表达组件转座到大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体上，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清侵染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白的方法。通过查阅相关文献资料，本文汇总了昆虫表达实验过程中常见的问题，分析了可能存在的原因以及解决办法。

1、昆虫细胞蛋白表达系统能否将两个基因共同表达？

答：昆虫细胞可以同时表达多个基因，杆状病毒衣壳内可以容纳较大的外源DNA插入片段，可以分别构建2个质粒，然后一起转染昆虫细胞，这种方式的优点是可以分别优化两个蛋白的表达水平，可以控制两个蛋白的表达平衡，相对于一个质粒共表达的方式缺点是在蛋白表达之前质粒构建，质粒抽提，蛋白病毒包被工作及成本费用都是增加一倍的；另一种共表达的方式是pFastBac Dual载体上构建两个目的基因，就可以同时表达两个蛋白。pFastBac Dual载体上两个启动子分别为PH和P10启动子，其中PH启动子蛋白表达效率要高于P10启动子。

2、昆虫病毒的保存方式对病毒有怎样的影响？

答：制备病毒时添加2%的细胞培养级别的BSA或者胎牛血清，有助于保护病毒，如果忘记添加，在收获病毒后添加，放在4度或者负80保存，短期使用（一般半年左右）可以放在4度，长期使用建议负80保存，再次使用建议检测一下病毒滴度或者做个表达小试，防止病毒滴度降低或失效。对于长期项目，放大项目也可以考虑制备BIIC,液氮保存。

3、哪一类蛋白更适合昆虫表达系统？

答：激酶、HDAC（组蛋白去乙酰化酶）、病毒/昆虫来源的蛋白、糖蛋白、细胞因子、衣壳蛋白、VLP、包膜蛋白、膜蛋白。这些蛋白有的本身属于比较困难表达的蛋白，可以使用昆虫体系尝试表达。

4、昆虫蛋白表达是用昆虫吗？

答：不是，是通过培养昆虫细胞来表达蛋白的，常用的昆虫表达宿主细胞系有Sf9、Sf21、Hi5、S2。也有用昆虫来表达蛋白的，比如家蚕，这个属于侵染昆虫，属于家蚕系统（BmNPV），家蚕表达蛋白能大量表达，但是家蚕表达蛋白后蛋白的纯化会非常困难，并且w66最给力的老牌的家蚕的培养环境和技术也有限，所以w66最给力的老牌不推荐家蚕来表达蛋白。

5、目的蛋白表达后和病毒一起释放到胞外吗？

答：目的蛋白是否释放到胞外主要由蛋白本身的性质决定以及是否添加信号肽决定，若目的蛋白在载体载体构建时加了信号肽，蛋白一般都会释放到胞外，但如果目的蛋白本身属于包内蛋白，如细胞骨架蛋白、核蛋白、胞质蛋白等，即便添加了信号肽，蛋白也可能不会释放到胞外。因此病毒的释放和目的蛋白的释放是两个过程，蛋白可能会和病毒一起释放到胞外，也可能会留在胞内。

6、目的基因是否是整合到昆虫细胞的基因中？

答：不是，外源基因一般不会轻易的整合到宿主基因组中，需要有特定的条件，昆虫体系中，杆状病毒携带目的基因进入宿主，利用宿主的环境进行自我复制和基因表达，目的基因并没有整合到宿主基因组中。

7、昆虫蛋白表达，目的蛋白大小是否有要求？

答：一般蛋白大小在10 kd-100 kd适合任何表达体系，110-250 kd的大蛋白首选昆虫表达系统。

8、通过添加助融剂得到的溶解蛋白与通过低温优化表达得到的溶解性蛋白有什么区别？助溶剂会影响蛋白活性吗？

答：助溶剂是比较温和的表面活性剂，是将本身不溶的蛋白变成溶解的蛋白。低温优化表达得到的溶解蛋白，是通过条件优化表达出溶解的蛋白。

助溶剂理论上对蛋白的活性影响很小，但是不确定助溶剂对蛋白的活性没有影响，主要看后续的实验是做什么，对蛋白的活性需求，如果担心助溶剂对蛋白的影响，可以更换体系表达或者尝试条件优化。

事实上，蛋白活性影响因素本身就很多，从表达系统上说大肠活性＜昆虫＜哺乳，大肠很多时候表达的蛋白都没活性，昆虫是不保证活性，哺乳是大部分都是有活性的；从蛋白角度分析：有的蛋白本身就是可溶性差的蛋白，亲水性比较差，在表达的时候就容易沉，沉淀就基本上没有活性。有些蛋白表达出来本身就没有活性，不论加不加助溶剂，蛋白都不会有活性，因此是否添加助溶剂与蛋白有没有活性，不成对等的关系，但如果需要有活性的蛋白，最好能表达出溶解的蛋白，并且不需要加助溶剂。

w66最给力的老牌生物拥有完善的昆虫表达纯化体系，昆虫细胞蛋白表达系统适合于，4次及以下跨膜蛋白几乎可以有效地在昆虫细胞中进行表达和纯化。是一件比较耗时耗力的事情，w66最给力的老牌生物科技可以提供纯度高达95%的全长膜蛋白定制产品。w66最给力的老牌可以为客户提供整套的蛋白表达方案，w66最给力的老牌免费对客户提供的基因进行序列分析检测；同时根据Sf9，Sf21，Hi-5及S2昆虫细胞的密码子偏爱性，免费为您进行密码子优化，从而有效提高重组蛋白表达量，为您提供一站式服务。