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qPCR实验常见问题

2024-01-09 阅读(247)

1、问:实验的重复性差怎么改进呢?

答:

(1)可能是在加样时不精准,建议更换一把移液枪再进行实验,或着是放大扩增体系;

(2)定量PCR仪没有定期校准,导致在不同位置温度不一样;

3)实验前qPCR反应液没有充分混匀。

 

2、问:Ct值出现过晚是因为什么呢?

答:(1)模板原因:可能是模板出现降解情况,需重新准备模板;

(2)反应条件不够优化或引物设计的不合理,应通过标准曲线确认扩增效率;

(3)PCR前加样量不足、反应成分的降解或是在实验中膜没有封闭好导致样品挥发;

(4)扩增产物过长:建议改用三步法进行反应或优化引物。

(5)反应体系中存在抑制剂,可以加大模板的稀释倍数,使抑制剂浓度降低或者重新制备模板进行实验。

 

 

3、问:熔解曲线不是单一的峰

答:

(1)出现非特异性扩增:可以对扩增条件和引物进行优化;还有可能是引物浓度高导致的,适当稀释引物,再进行实验;

(2)模板DNA有污染,使用新制备的cDNA模板即可。

 

4、其他孔位的扩增曲线没有异常,有几个孔位的是不规则的扩增曲线怎么回事(如图)?

 

答:可能孔位溶液面有气泡,气泡导致荧光发生折射,在气泡破掉的时候就会导致荧光信号发生急剧的变化,干扰对荧光信号的收集;在实验过程中,要注意尽量减少产生气泡。

 

5、PCR扩增曲线平台区呈锯齿状,是怎么回事呢?

 

答:可能是由于RNA纯度低,可以梯度稀释模板倍数看优化效果或着重新准备一批高纯度RNA进行实验。

 

6、溶解曲线峰比较乱,是因为什么?

答:

(1)反应体系有污染,根据空白对照排除影响原因,如:水,酶,引物等;

(2)试剂反复冻融曝光,导致试剂失效,可以使用新的试剂做对比实验,排除试剂原因;

(3)若仪器放置很久,可能是仪器需要校准。

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