w66最给力的老牌

抗体文库代表来自特定宿主物种的抗体库的集合。文库来源于 B 淋巴细胞 (B 细胞) 或从通过密度梯度离心获得的外周血单核细胞 (PBMC) 中回收。这些细胞随后用于 mRNA 分离和 cDNA 合成，以产生足够质量和数量的 DNA 模板，用于抗体编码基因（VL 和 VH 链）的 PCR 扩增。

文库可以以不同的格式生成，即 VHH（来自骆驼科动物）、Fab（抗原结合片段）和 scFv（单链可变片段）。后两种格式需要 VH 和 VL 链的随机配对步骤，因为该信息在文库构建期间丢失。抗体库还可以分类为：

天然 – 来自从未受到特定抗原侵染的原始宿主

免疫– 来自用特定抗

原免疫后的宿主

合成– 通过计算（计算机）和/或实验方法（随机或定点诱变）从可用抗体序列生成

半合成– 合成和天然（初始/免疫）抗体序列的混合物

这些抗体库适用于哪些应用？

哪种抗体库更有利于抗体发现？

一般而言，在抗体发现方面，天然文库比免疫或合成文库更有优势。高质量的天然文库通常会收集数十个宿主或个体的多样性，并具有多达 10^ 11 个不同的克隆。高度的多样性保证了抗体库的功能和针对许多不同抗原的能力。

由于这些原因，在生成具有“新”功能的抗体时，天然文库是首选。另一个优点是，尽管建库是一个繁琐的过程，但天然文库只构建一次，并且可以反复用于多种不同的项目和抗原。相比之下，免疫文库被保留用于更具体的项目，其中抗体亲和力可能发挥更重要的作用。此外，这些库仅用于单个项目，因此与天然库相比成本效益更低。

如何克隆抗体库？

​抗体库的存储取决于它们设计用于服务的展示方法。例如，用于抗体噬菌体展示的文库通常被克隆到噬菌体/噬菌体载体中，并在噬菌体的天然宿主生物体（通常是大肠杆菌菌株）中进行扩增。

与其他展示方法相比，该技术中使用的噬菌体/细菌系统具有重要的优势。例如，大肠杆菌生长迅速，在营养可用性方面的要求特别简单。因此，噬菌粒/噬菌体文库的扩增非常简单，并且可以在用于筛选之前相当快地完成。

这些库是如何筛选的？

使用复杂文库进行抗体发现的早期尝试是使用经过修饰（放射性标记）抗原，花费大量的时间和劳动，通过菌落筛选试验进行的。如今，通过应用初始富集步骤，可以更轻松地从高多样性文库中选择抗体，而在筛选步骤之前消除亲和力最低的结合物。

几十年来，已经开发了许多抗体展示技术，以实现抗体的有效富集（生物淘选）和筛选。但最强大和最具成本效益的技术仍然是噬菌体展示技术。基于噬菌体/大肠杆菌系统，噬菌体展示具有通用性和灵活性，可以快速适应多种不同的抗原和检测条件。

什么是噬菌体展示技术？

噬菌体展示技术是一种二元系统，包括使用载有蛋白质、抗体或肽的噬菌体颗粒，这些颗粒可以很容易地在其相应的细菌宿主中繁殖。作为一般原则，噬菌体展示是一种研究蛋白质-配体相互作用的体外方法。蛋白质或肽通常与衣壳蛋白之一融合并表达为杂合构建体。基因型和表型之间的这种联系允许通过简单的生物淘选过程直接筛选大量蛋白质/肽库。

一般而言，生物淘选包括将携带不同蛋白质或肽的几种噬菌体颗粒与固定在珠子（悬浮液）或平板（半固相测定）上的特定靶标一起孵育。噬菌体文库可以是消极的也可以是积极的。在第一种情况下，负靶向可用于去除与不需要的配体结合的噬菌体蛋白颗粒，而正靶向（最常见的方法）可用于富集对所需靶标具有高亲和力的结合剂。

在每个淘选步骤后回收所需的噬菌体并在大肠杆菌中扩增 。该过程重复 4-6 次，从而逐步富集所需的粘合剂。然后，以所需格式（ELISA、WB 或流式细胞术）筛选单个克隆，并通过 DNA 测序进行表征。

抗体展示中通常使用哪些噬菌体？

丝状大肠杆菌噬菌体 M13 是与密切相关的大肠杆菌噬菌体 fd 和 f1一起 用于抗体噬菌体展示的最广泛使用的系统。这些噬菌体相对于其他噬菌体的一个明显优势是它们的非裂解性质，通过这种方式，它们在大肠杆菌中繁殖而不裂解细胞，允许使用简单的 PEG 沉淀过程快速纯化噬菌体，将它们与细胞蛋白分离。在生物淘选轮次之间。

其他噬菌体已用于展示，如 T7、T4 和 λ 大肠杆菌噬菌体，但是，由于它们的裂解性质，它们尚未找到有效的适用性。由于它们在扩增过程中裂解大肠杆菌，这使生物淘选之间的多个纯化步骤变得复杂。因此，这些系统很少用于噬菌体展示。

M13噬菌体展示系统如何工作？

在 M13 中，蛋白质/肽与衣壳蛋白之一—次要外壳蛋白 pIII（或 gp3）或主要外壳蛋白 pVIII（或 gp8）相连。pIII 以每个噬菌体颗粒 5 个拷贝存在，而 pVIII 以每个病毒粒子 2700 个拷贝存在。因此，pIII 融合体以较低的价态存在，而 pVIII 以较高的价态存在，因此，pIII 有利于选择具有强亲和力的结合物，并且 pVIII 构建体可用于回收具有较低亲和力的结合物。

然而，pIII 系统的挑战之一在于这种衣壳蛋白在感染性中的关键作用。M13 通过 pIII/F 因子相互作用粘附在大肠杆菌上，因此，必须保留其原始功能以允许阳性选择的噬菌体复制。通过创建噬菌粒系统并将它们与辅助噬菌体结合使用，出现了应对这一问题的解决方案。Phagemids 仅包含基本元素：

编码pIII 蛋白/肽/抗体融合蛋白的基因

一个复制起点

选择标记（通常是抗生素抗性基因）

相比之下，辅助噬菌体包含感染性、复制和病毒体组装所必需的所有元素，但缺乏与 pIII 融合的蛋白质/肽片段，并且包含弱化的复制起点。因此，噬菌粒/辅助噬菌体系统产生具有天然 pIII 和 pIII 蛋白融合构建体（1-5 个拷贝）的混合表型的病毒粒子。

噬菌体展示的主要应用是什么？

由于噬菌体展示允许研究蛋白质-配体相互作用，因此其应用非常多样化。其中一个噬菌体展示的最重要的应用程序可以在抗体发现领域中找到。与初始、免疫或合成文库相结合，噬菌体展示可以帮助研究人员找到具有治疗、诊断和研究应用新功能的抗体。

该技术的另一个用途在于抗体工程和先导优化。噬菌体展示已被广泛用作优化抗原选择性（交叉反应性）、亲和力和可开发性的工具。这是通过构建从计算或实验诱变（随机或定点）获得的合成库、丰富有希望的变体并在所需条件和应用中筛选其活性来反复实现的。

最后，噬菌体展示作为表位作图的工具。通过展示针对单个纯化抗体的肽或蛋白质，可以确定其表位特异性，在开发特别复杂的疗法（如寡克隆抗体（抗体混合物）或用于夹心 ELISA 测试的抗体对）时，这是非常宝贵的依据。

使用噬菌体展示进行治疗性抗体的开发有哪些好处?

与杂交瘤相比，噬菌体展示技术允许开发完全人源抗体。这样，就不需要进一步的人性化，让研究人员可以节省精力、时间和成本，大大加快临床前和临床开发。