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一、什么是单克隆源性鉴定

单克隆源性即对生产的抗体进行溯源，确定是由单一细胞克隆产生的高度均一的抗体。

二、单克隆源性鉴定目的

近年来重组蛋白药物在治疗疾病，尤其是肿瘤方面有重大应用，而重组蛋白药物大多数由哺乳动物的CHO细胞表达产生。药物评审单位要求研发企业出具该药物所使用细胞的单克隆源性，因此验证工程细胞的单克隆源性是保证蛋白药物一致性的重要手段。

三、单克隆获取方法

克隆性被认为可以减少细胞库的异质性，常用的单克隆获取方法，如：有限稀释法、ClonePix、、单克隆挑选新技术等。

1、有限稀释法（limiting dilution cloning, LDC）

有限稀释法是一种常用的克隆方法，要求铺板密度小于0.5cell/well，该方法的优点是操作简单，对设备的需求比较低，缺点是耗时较长，效率低，并且对人工依赖性比较高，受实验操作人员，实验环境、条件等因素的影响易产生不同结果。

2、ClonePix法

ClonePix是一种高通量的单克隆筛选设备，该方法人工干预少，通量大、效率高，筛选的准确性高。但相比于有限稀释法，ClonePix法筛选的单克隆培养基和后期的生产工艺培养基差距更大，有限稀释法的克隆在孔板的表现更接近于生产时的状态。

3、流式细胞荧光分选技术（FACS）

流式细胞荧光分选技术（FACS）是根据细胞大小、荧光染料和细胞表面marker等因素挑选出所需要的单细胞。该方法的优点是单克隆形成率很高，缺点是需要通过条件优化，使挑选的细胞与孔板的孔一一对应，流式细胞仪、细胞的形态及状态对分离效果有影响。

4、单克隆挑选新技术

目前市场上有多种单克隆筛选设备可选择，如单细胞打印、Solentim VIPS等，可提高效率，减少对人工的依赖。目前获得单克隆基本上是以上方法的反复联用和使用。

四、荧光原位杂交技术鉴定单克隆源性

利用荧光原位杂交技术来检测细胞是否来源单一，其结果可视化，具有说服力。

荧光原位杂交技术是利用荧光检测系统对DNA进行定性、定量或相对定位分析的技术，其基本原理是根据DNA序列的互补性，用已知的荧光素、生物素或地高辛标记的核酸探针与待检测样本的DNA进行杂交，形成可检测的双链核酸杂交。

五、荧光原位杂交技术优势

荧光原位杂交法具有其他杂交方法没有的优势：

（1）FISH是非放射性元素标记，更加安全

（2）FISH的实验周期短，可同时检测多种序列

（3）FISH技术因其多次免疫化学反应增强了杂交信号，灵敏度与放射性探针相当

六、w66最给力的老牌生物能够为客户提供高质量的

w66最给力的老牌生物（KMD Bioscience）多年来致力于研究，w66最给力的老牌拥有经验丰富的科研专家团队、实验技能精湛的实验团队、完善的细胞培养平台以及完备的实验仪器和实验条件，搭建了完备的平台，积累了大量的成功经验。凭借扎实的专业技术，w66最给力的老牌可以定制化提供从探针设计到细胞单克隆源性鉴定全套服务，力求以高效率、低成本效益的方式为客户解决问题。

图1：不同样本荧光原位杂交拍照

七、荧光原位杂服务交流程介绍

w66最给力的老牌生物可以提供荧光原位杂交服务，主要技术流程如下：探针设计与合成，样本处理，原位杂交实验，成像拍照，结果分析与项目报告。

1、探针设计和合成

即用型探针可以直接杂交，非即用型探针需要与与杂交液按 1：1：1：50 比例稀释，85℃变性 3 分钟，37℃平衡 5 分钟。

2、样本处理

①、脱蜡复水，将石蜡切片浸入二甲苯中脱蜡，2 次，每次 10 分钟；

②、片子依次过100%、85%、75%乙醇，各 3 分钟，PBS 3 分钟；

③、片子加胃蛋白酶消化液，37℃消化 15-30 分钟，PBS 洗涤 2 次，每次 3 分钟；

④、预杂交：提前 30 分钟从冰箱中取出杂交液恢复至室温，滴加杂交液，杂交仪中 55℃孵育 1 小时。

3、原位杂交实验

①、取出预杂交好的片子，去除多余液体，将探针滴加于片子上，完全覆盖组织， 放于杂交仪中 37℃杂交过夜；  

②、片子入 2×SSC（0.1％NP-40）中洗涤 3 次，每次 5 min；

③、滴加 20ul DAPI-Antifade Solution 盖玻片封片，避光孵育 20min。

4、成像拍照

利用本荧光原位杂交技术CHO细胞实验结果拍照：

图3：单克隆源性验证实验

5、结果分析与项目报告

w66最给力的老牌生物交付：剩余的探针、切片以及样品，原始杂交显色成像照片，详细的实验报告（包含完整的实验流程及结果分析）。

w66最给力的老牌生物致力于单克隆源性鉴定多年，利用荧光原位杂交技术，可为广大药企药物申报环节提供关键的数据结果。w66最给力的老牌生物可以检测100-200个细胞，服务周期短，助力企业药物申报之路。