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什么是杂交瘤？

杂交瘤可以定义为能够在标准实验室条件下无限期产生抗体的杂交细胞系。与其他抗体发现方法相比，杂交瘤产生的抗体具有更高的亲和力、稳定性和特异性。

杂交瘤细胞是如何产生的？

融合的浆细胞（分泌积极高亲和力抗体）与兼容骨髓瘤伙伴（恶性浆细胞通常从同一机体）分离的杂交瘤细胞系。该过程可以由化学或物理信号（即电信号）介导，并导致这些高产和抗体分泌细胞系的永生化。

如何选择正确融合的杂交瘤？

浆细胞与其相应的骨髓瘤伙伴的融合并非 100% 有效。即使在最佳条件和最有效的刺激下，细胞融合仍然会产生需要分离的未融合和融合细胞的混合物。

由于浆细胞寿命短，因此很容易消除它们，但消除未融合的骨髓瘤更为复杂。为了提高选择过程的效率，用于融合的骨髓瘤伴侣缺乏核苷酸补救途径的关键酶 HGPRT。然后将混合物在HAT 培养基（次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶）中培养，其中只有具有 HGPRT 酶的细胞（从浆细胞继承 HGPRT 的杂交瘤）才能存活。

如何筛选杂交瘤细胞系的抗体活性？

在初始阶段，可以使用 ELISA（酶联免疫吸附试验）筛选杂交瘤，适用于快速筛选多个样本。然而，ELISA 并不总是最适合所有应用的方法。例如，设计用于靶向膜结合受体的治疗应用可能最好使用替代方法进行评估，例如流式细胞术，可以比 ELISA 更准确地预测与膜蛋白的相互作用。相比之下，对于诊断应用，在目标应用（例如ELISA、流式细胞术、蛋白质印迹、免疫组织化学等），因为抗体的结合亲和力会根据样品类型和特定的检测条件而变化。

为什么阳性杂交瘤被亚克隆？

在初始 ELISA 筛选过程中确定阳性孔后，将杂交瘤转移到更大体积（即 24 孔板）中，为亚克隆程序做准备。杂交瘤的亚克隆通常通过有限稀释方法进行，以确保分离稳定的单克隆。该方法包括稀释杂交瘤培养物并将它们分散到 96 孔板中以实现单克隆性（每孔一个细胞）。为降低产生混合杂交瘤群体的风险，应至少进行两次有限稀释。

杂交瘤生产的理想抗原是什么？

成功的杂交瘤生成首先取决于宿主独特的免疫反应。因此，用于免疫的抗原需要引起强烈的体液反应，或者换句话说，它们需要具有免疫原性。并非所有抗原物质（蛋白质、小分子、脂质、碳水化合物、肽）都具有免疫原性。这种能力取决于抗原来源的生物体和用于产生杂交瘤的宿主生物体之间共有的同源性。这两种生物距离越远，宿主对目标目标发起有效免疫反应的机会就越大。

最常用的抗原包括细胞、蛋白质、肽和 DNA。蛋白质和肽是最受欢迎的选择，因为它们允许更精确的靶向。通过使用蛋白质，可以迫使杂交瘤中产生的抗体靶向病原体或蛋白质复合物的特定区域。此外，通过使用肽，可以设计杂交瘤以靶向特定表位或严格数量的不同表位。但由于大多数肽没有足够的免疫原性，它们通常与载体（佐剂）结合以确保宿主生物体可以将它们识别为外来物。

DNA 免疫和细胞免疫（在其表面表达抗原的重组细胞）是处理不稳定或复杂抗原（如 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 和其他膜结合蛋白）的首选方法。当抗原呈现对抗体活性起决定性作用的特定翻译后修饰时，也可以使用 DNA 免疫。

总之，选择正确的抗原不仅取决于其天然结构和来源，还取决于用于产生杂交瘤的宿主的免疫系统。

杂交瘤是如何产生单克隆抗体的？

杂交瘤是永生化浆细胞的产物，这些浆细胞之前经历了激活（通过抗原）和亲和力成熟（通过重组）的过程。因此，这些细胞系代表了 B 细胞发育的最高级阶段。这些杂交瘤产生高亲和力的单克隆抗体（即小鼠杂交瘤中的 IgG 或 IgA）并将它们分泌到培养基中。如果生长培养基不含血清（包含痕量非特异性抗体），则可以使用固定蛋白 A、G 或 L 的树脂通过直接纯化轻松提取目标抗体。

使用杂交瘤技术进行抗体发现有哪些好处和局限性？

杂交瘤技术是由在剑桥 MRC 分子生物学实验室工作的科学家 George Köhler 和 Cesar Milstein 在 1970 年代首次开发的。在抗体发现中的得到充分证实。这些杂交细胞系因其能够以最具成本效益的方式产生具有高亲和力、稳定性和特异性的抗体而备受赞誉。相比之下，与体外抗体生成技术相比，杂交瘤及其相应的骨髓瘤融合伙伴的开发需要大量时间。

为什么杂交瘤会生产结合亲和力最高的抗体？

杂交瘤是从完全成熟的浆细胞（效应 B 细胞）中获得的。这些细胞通常由称为关联识别的复杂过程产生。抗原 ，但实际过程需要多种细胞类型之间的合作，包括 抗原呈递细胞 （APC，消化复杂的外来分子所必需的）、  T 细胞 （由 APC 激活）和 B 细胞 （由 T 细胞激活） ）。当 B 和 T 细胞识别相同的抗原时（链接识别)，T 细胞释放化学信号，驱动抗体亲和力成熟和类别转换（从 IgM 到 IgG/IgA/IgE 产生）的过程，最终导致产生高亲和力单克隆抗体。

哪些宿主可用于杂交瘤生产？

杂交瘤技术最初是在小鼠身上开发的 。由于基因接近，这项技术很容易适应其他啮齿动物，如大鼠 或豚鼠，当使用小鼠骨髓瘤伴侣进行细胞融合时，这些啮齿动物 通常可以产生稳定的杂交瘤。

杂交瘤生产的抗体适用于哪些应用？

考虑到大多数杂交瘤来源于小鼠或其他啮齿动物，杂交瘤产生的抗体通常是鼠类 IgG 分子。鼠抗体与人抗体的同源性较低，因此，长期使用这些分子可能会引发人抗小鼠抗体 (HAMA) 反应的发展，导致更快地从生物体中清除，降低治疗效率，有时还会出现不良过敏反应。

出于这个原因，鼠类抗体在被认为适合治疗应用之前需要进行人源化。尽管与体外方法相比，这种方法的周转时间更长，但来自小鼠杂交瘤的人源化抗体仍然是最成功的生物治疗剂之一。

相比之下，鼠抗体非常适合诊断应用。由于小鼠杂交瘤技术的成本效益和使用杂交瘤天然生产少量单克隆抗体（足以满足大多数诊断应用）的可能性，绝大多数诊断抗体源自鼠源。

单个杂交瘤生产的抗体能否用于所有类型的诊断应用？

开发一种能够在流式细胞术、ELISA、蛋白质印迹、免疫组织化学等许多不同应用中表现良好的抗体非常具有挑战性。原因是这些平台在测定条件和样品制备方面存在差异。例如，WB 应用需要靶向线性表位（肽）的抗体，因为来自给定样品的所有蛋白质在抗体结合之前都已变性。相比之下，流式细胞术主要用于液体样品，其中抗原预计会保持其天然构象，因此，抗体需要能够靶向暴露区域。

样品组成也会影响给定抗体的性能。例如，某些组织或生物体液可能含有丰富的成分，这些成分与您感兴趣的抗原共享一些保守区域。因此，某些特定样品可能会促进脱靶结合，从而导致高背景噪音，并经常导致不确定或错误的结果。

出于这个原因，所有用于诊断的抗体都应该在特定的检测格式、条件、样品类型和采用所需的样品制备方案中进行适当的验证。

如何体外培养杂交瘤？

有几种方法可以在体外培养杂交瘤。直到最近，腹水生产方法是最常见的工艺。然而，这种方法需要使用动物，而且通常会产生含有痕量非特异性抗体和其他动物源性污染物的库存。

w66最给力的老牌的建议是在悬浮培养中培养杂交瘤。大多数杂交瘤细胞系可以在标准实验室条件下生长，w66最给力的老牌相信这是一种更人性化的抗体生产方法。w66最给力的老牌的建议也与欧盟的最新报告一致，该报告在存在可行的替代方案时不鼓励在抗体生产中使用动物（EURL ECVAM 关于非动物衍生抗体的建议，于 2020 年 5 月发布）。

考虑到这一建议，杂交瘤可以在血清（例如 8-10% FCS – 胎牛血清或类似试剂）存在的情况下悬浮生长，并辅以谷氨酰胺（已知可刺激抗体产生）和抗生素（以减少细菌污染）。 然而，血清也含有痕量的非特异性抗体和其他动物源性污染物。为了克服这个问题并生产出更高纯度的原液，杂交瘤可以适应无血清和化学成分确定的培养基。