w66最给力的老牌生物科技（天津）有限公司
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w66最给力的老牌生物(KMD Bioscience)在抗体发现领域多年，能够为客户提供高质量的、骆驼来源的VHH抗体噬菌体展示文库制备服务。w66最给力的老牌的科学家采用人用疫苗级别和生物制药的QbD（Quality by Design）设计原则，在理解和尊重ICH原则的基础上，设计并制备骆驼VHH抗体噬菌体展示文库，为客户提供全程可追溯的产品追溯体系和文件支撑体系，包括抗原设计，动物免疫，文库构建与筛选，功能验证等主要环节。
骆驼抗体文库制备-重链抗体背景：
传统意义上血清抗体主要包括IgG1，IgG2，IgG3和IgG4 四种亚型，而骆驼主要血清抗体包括IgG1，IgG2和IgG3三种类型，其中IgG1与传统抗体结构相似，含有2条重链和2条轻链；IgG2和IgG3缺少CH1和轻链结构域，因此也被称为重链抗体(heavy Chain Antibody，hcAb)，如图1所示：
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图1 经典抗体与重链抗体模式结构
(a) 传统抗体及其Fab/scFv抗体形式 (b) 重链抗体及其VHH抗体形式
重链抗体（单域抗体）在羊驼和骆驼血清中的分部是不均衡的，骆驼血清抗体中重链抗体占比约为60-75%，羊驼血清抗体中重链抗体占比约为40-50%。这种显著的差异导致了构建的骆驼VHH抗体文库（骆驼纳米抗体文库）具有先天的优势，如表1所示。骆驼抗体文库主要是指利用骆驼重链抗体的可变区，即VHH区域序列构建的VHH抗体文库，又叫纳米抗体文库。VHH抗体（单域抗体）的特点是只含有重链抗体的抗原结合区，如图2所示，氨基酸长度约为110AA，SDS-PAGE显示分子量约为15kDa（远小于传统抗体150kDa的分子量），具有较好的稳定性，能够抵抗低pH环境。 同时在VHH人源化改造方面，也具有良好的适应性，容易满足Car-T等免疫细胞的改造和分选实验要求。
图2 骆驼重链抗体与VHH抗体模式
骆驼与羊驼VHH抗体文库对比：
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比较项目 |
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抗原耐受量 |
高，多种抗原混合，高剂量免疫 |
较高，多种抗原混合中等免疫剂量 |
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抗血清滴度 |
高 |
高 |
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中和抗体效价 |
高 |
较高 |
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抗体亲和力 |
更容易获得高亲和力抗体 |
能够获得高亲和力抗体 |
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抗原需求量 |
4-6mg，纯度>85% |
2-3mg，纯度>85% |
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采血量 |
一次可采血200ml |
一次80-100ml血液 |
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PBMC细胞量 |
高 |
一般 |
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有效库容 |
高，免疫库108-109 |
高，免疫库107-108 |
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动物成本 |
较低 |
高 |
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小分子抗原反应性 |
高 |
一般 |
文库制备-骆驼VHH抗体库构建服务：
w66最给力的老牌生物科技(KMD Bioscience)能够为客户提供高质量的、骆驼来源的纳米抗体噬菌体展示文库制备服务。w66最给力的老牌坚持采用人用疫苗和生物制药的QbD（Quality by Design）设计原则，在理解和尊重ICH原则的基础上，设计并制备骆驼VHH抗体噬菌体展示文库，为客户提供全程可追溯的产品追溯体系和文件支撑体系。VHH抗体噬菌体展示文库包含抗原设计，动物免疫，文库构建与筛选等主要环节。
VHH抗体噬菌体展示文库-抗原设计：
针对骆驼VHH抗体文库，w66最给力的老牌设计了一系列来自于骆驼抗体Fc融合表达的人源免疫检查点蛋白。结合w66最给力的老牌成熟的Freestyle 293F和Expi CHO细胞悬浮表达平台，w66最给力的老牌能够为客户在较短的周期内从基因合成，载体构建到克级蛋白的表达，更多的服务需求，请咨询w66最给力的老牌的蛋白表达平台。同时，根据w66最给力的老牌的实验结果，w66最给力的老牌发现小分子靶蛋白直接与人源Fc片段融合后免疫效果要好于靶蛋白融合骆驼Fc片段后免疫结果（具体实验结果，请联系w66最给力的老牌的技术人员）。
VHH抗体噬菌体展示文库之文库构建与筛选：
w66最给力的老牌生物(KMD Bioscience)的骆驼种群来源于欧洲，公司可以提供未经免疫的，足龄（24-36月龄）的骆驼进行抗原免疫，按照标准免疫方法，每个项目免疫5-6针，免疫期间为客户提供ELISA效价测定服务，保证抗血清ELISA效价合格后采血分离PBMC。
w66最给力的老牌生物(KMD Bioscience)采用M13噬菌体的pIII蛋白进行VHH抗体(纳米抗体)表面展示。w66最给力的老牌的科学家构建了带有Flag和6*His tag双标签的噬菌体载体，同时制备出了具有108转染效率的TG1和XL1-Blue宿主菌感受态，经过2-3次转染与扩增，能够为客户提供有效库容量为108-109，且包装库容为1013-1016/ml颗粒数的高质量纳米抗体展示文库。通过抗原极限施压筛选方式，经过3轮纳米抗体文库淘筛，即可获得多达20-30株具有高亲和力的噬菌体株。通过简单的IPTG诱导，即可在1-2周内获得大量抗体表达产物，以满足客户FACS，细胞活性测试等研究需求。
驼源抗体文库制备---项目流程：
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步骤 |
服务内容 |
周期 |
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Step1：动物免疫 |
* 准备1只健康、足龄双峰驼(28-36月龄)
* 免疫骆驼5-6次
* ELISA检测血清效价，效价满足要求后取外周血；若效价不满足要求，则终止试验 |
6-8周 |
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Step2：抗体cDNA制备（客户可以直接提供细胞，从此步开始） |
* 总RNA提取
* 高保真RT-PCR制备cDNA |
3-4周 |
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Step3：构建驼源抗体库 |
* 引物设计与合成：抗体可变区兼并引物设计、合成
* 以cDNA为模板，PCR扩增重链抗体基因可变区
* 噬粒构建与转化：酶切、连接噬菌粒载体，电击转化TG1宿主菌，构建抗体库
* 鉴定：随机挑选96个克隆，PCR鉴定阳性率
* 包装，＞1⨯1013 /ml噬菌体颗粒 |
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Step4: 文库淘筛
(3轮) |
* 抗原极限施压法进行3轮淘筛
* 鉴定：随机挑选96个克隆，ELISA效价测定
* 多达96个阳性克隆进行基因测序，挑选10-15个克隆进行原核表达转化
* 10-15个阳性克隆表达制备VHH抗体上清 |
3-4周 |
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交付 |
* 驼源抗体文库的构建与筛选报告，包括测序报告，图片数据 * VHH抗体文库2ml，＞1⨯1013 /ml噬菌体颗粒
* 10-15个阳性克隆表达制备VHH抗体上清
* 10-15个阳性克隆表达菌种 |
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注：1.客户提供骆驼外周血淋巴细胞，淋巴结细胞或脾脏细胞（保存在RNA later等溶液中，避免RNA降解，蓝冰运输），从第二步开始制备VHH抗体文库，只需3-4周即可完成。
2. 采用TriZol溶液制备细胞裂解物，干冰运输。
骆驼抗体文库制备服务优势 ：
--同时提供免疫库制备服务和天然骆驼抗体文库筛选服务
--周期短，约16-20周即可获得高质量的文库和单抗细胞株
--高库容量：有效库容 108 – 109/免疫库；109 – 1011/天然库
--高亲和力抗体制备
--个性化的淘筛策略
--完整的文件追溯体系和QC质控文件
驼源抗体文库制备----实验流程：
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